中藥材快檢方法研究-鄭州藥分會(huì)-杜慶鵬課件

中藥材中金屬汞、鎘元素和兩類(lèi)（總有機(jī)磷、氨基甲酸酯）農(nóng)藥的殘留量的快速檢測(cè)方法研究

中國(guó)藥品生物制品檢定所

中藥與民族藥檢驗(yàn)管理處

2010-03-03由于中藥的安全性已經(jīng)嚴(yán)重阻礙中藥的臨床應(yīng)用和發(fā)展。目前，我國(guó)已逐步制訂完善了中藥材和中成藥中重金屬元素和農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法和限量標(biāo)準(zhǔn)。但在配合重大安全預(yù)警事件反應(yīng)缺失、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面研究的涵蓋面不夠，需進(jìn)一步深入系統(tǒng)地研究中藥有害殘留物快速檢測(cè)方法。簡(jiǎn)介主要內(nèi)容一、中藥材中汞快速檢測(cè)試紙方法研究（紙片法）二、中藥材中鎘快速檢測(cè)試紙方法研究（紙片法）三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留

快速測(cè)定方法（速測(cè)卡）一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究方法原理

在酸性條件下，顯色劑二苯碳酰二肼（DPC）與Hg2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成紫紅色絡(luò)合物（520nm），檢測(cè)試紙由白色變?yōu)樽霞t色，顏色的深淺與Hg2+的含量成正比。儀器與試劑

二苯碳酰二肼；乳化劑OP；緩沖溶液：pH9.0的硼砂-NaOH緩沖體系；分析用定量濾紙圖1自制反應(yīng)裝置A-為100ml標(biāo)準(zhǔn)錐形瓶；B-帶彎口中空的標(biāo)準(zhǔn)磨口塞，上連彎口的乳膠導(dǎo)氣管C；D-為玻璃口；E-帶刻度玻璃管或者塑料管。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究試紙制作

取10ml0.5%二苯碳酰二肼乙醇溶液，加入2ml12%乳化劑OP；將定量分析用濾紙剪成0.6cm寬的試紙條，用上述溶液充分浸泡后自然晾干，備用。使用時(shí)，剪成0.6×0.8cm試紙片。試紙使用方法

取3.0ml待測(cè)樣品，加入1.0ml緩沖溶液；從試紙瓶中快速取出一條汞檢測(cè)試紙浸入上述樣品溶液中，20秒后取出；檢視，與對(duì)照顏色比較，即可對(duì)樣品中汞含量進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。粉紅紫紅一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究標(biāo)準(zhǔn)色階

分別取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液3ml置10ml刻度試管中，加1mlpH=9.0的硼酸-氯化鉀緩沖液，混勻，用1％NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0左右，取試紙片置于上述溶液中浸泡片刻，取出檢視。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究條件優(yōu)化反應(yīng)酸度的選擇

試驗(yàn)中遇到試紙本底顏色變化較大嚴(yán)重影響顏色判斷的問(wèn)題，經(jīng)查找原因發(fā)現(xiàn)酸度的強(qiáng)弱影響試紙本底的顏色，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的檢視。為了減少這種本底顯色的干擾，對(duì)在不同的酸度條件下試紙本底的顯色進(jìn)行了研究，經(jīng)優(yōu)化選擇在pH=5.0的酸性條件下本底顯色最淺，對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾會(huì)最小。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究表面活性劑的選擇

由于在紙層析實(shí)驗(yàn)中易出現(xiàn)擴(kuò)散，影響結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用加入一定量表面活性劑，使待測(cè)體系的穩(wěn)定性增加并且能減小顏色擴(kuò)散程度，因此實(shí)驗(yàn)中分別比較了10%、12%、15%的OP乳化劑含量時(shí)試紙的顯色以及色階的情況。12%和15%的色階明顯好于10%，而12%和15%結(jié)果差別不大，因此試驗(yàn)采取加入2ml12%的乳化劑OP量。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究紙片顯色時(shí)間及絡(luò)合物的穩(wěn)定性

紙片浸泡片刻后，將試紙片取出放置到白色PV底板上在0~30分鐘內(nèi)觀察顏色的變化。

隨著試紙暴露在空氣中時(shí)間的延長(zhǎng)，顯色越深，色階越不明顯。因此最佳的觀察時(shí)間應(yīng)該在試紙取出之后，待殘留在白板上的液體揮發(fā)完全而試紙表面仍舊保持濕潤(rùn)的情況下檢視（觀察）。具體觀察的時(shí)間可以根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)具體情況具體掌握。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究樣品提取酸液的酸度選擇

分別采取1%、3%、5%的鹽酸進(jìn)行提取試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3%的鹽酸空白本底干擾較小，而且與起泡劑的反應(yīng)速度適中，因此選擇3%的鹽酸作為提取樣品溶液一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究回收試驗(yàn)

取中藥材黃芪粗粉約2.0g置于50ml錐形瓶，加20ml3%HCl，分別添加汞1、10μg/ml對(duì)照品溶液，振搖10min，按上述方法操作一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究產(chǎn)氣劑的回收效率

對(duì)3ml含汞（5μg/ml）的標(biāo)準(zhǔn)液，按標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)氣得3毫升吸收液（回收液），與標(biāo)準(zhǔn)的吸收液3ml（含汞濃度5μg/ml、對(duì)照溶液）相比較。從圖看略有差異。說(shuō)明該操作方法下，溶液轉(zhuǎn)換較為完全。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究結(jié)果與討論

*目前已經(jīng)市場(chǎng)化的汞快速測(cè)定的方法，比如北京一家公司所生產(chǎn)的銅片法快速測(cè)定汞含量。我們將銅片法與我們的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)，銅片法只有當(dāng)汞的含量大于20μg/ml時(shí)銅片表面才會(huì)出現(xiàn)銀灰色，而且現(xiàn)象不明顯，不太好判斷，此方法靈敏度較低，而且實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，不方便現(xiàn)場(chǎng)操作，而我們的方法靈敏度較高（3μg/ml），并且實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，易操作，不需要加熱，適用于現(xiàn)場(chǎng)操作，為中藥材中重金屬汞的現(xiàn)場(chǎng)質(zhì)量控制提供了比較好的方法依據(jù)。方法驗(yàn)證

濃度為1μg/ml的汞標(biāo)準(zhǔn)溶液加產(chǎn)氣劑，按標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)氣得吸收液，用原子熒光法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果吸收液汞含量為1.01μg/ml，同時(shí)進(jìn)行試紙法測(cè)定，結(jié)果表明該溶液汞含量為1μg/ml左右。產(chǎn)氣后的溶液殘留汞含量為0.012μg/ml，試紙法測(cè)定結(jié)果為空白色。

結(jié)果說(shuō)明：

（1）產(chǎn)氣劑反應(yīng)較完全，

（2）試紙法測(cè)定結(jié)果與儀器分析法檢驗(yàn)結(jié)果基本一致。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究一、中藥材中重金屬汞的快速檢測(cè)方法研究結(jié)果與討論*顯色劑使用過(guò)程中要避光。*制作好的試紙要避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)取，不可置于空氣中過(guò)長(zhǎng)時(shí)間。*由于試紙片顏色變化為櫻紅色到紫紅色，兩種顏色干擾較大，基于肉眼觀察的基礎(chǔ)，我們認(rèn)為當(dāng)最低檢出濃度為3μg/ml時(shí)人眼觀察比較明顯，誤判的幾率會(huì)大大減少，而且比較時(shí)最好同時(shí)做一隨行對(duì)照，并且最好使用同一批次的紙片。*有條件的情況下可以將產(chǎn)氣劑壓成片子，直接使用，既攜帶方便又減少了稱(chēng)量過(guò)程，同時(shí)還保證產(chǎn)氣反應(yīng)相對(duì)持久。*處理樣品時(shí)采用投入產(chǎn)氣劑的方式，操作簡(jiǎn)單，樣品的顏色等因素不會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并且不會(huì)引入其他的干擾離子。二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測(cè)方法研究方法原理

在堿性條件下，鎘試劑與Cd2+反應(yīng)生成橘紅色絡(luò)合物（330nm），顏色的深淺與Cd2+的含量成正比，通過(guò)顏色的深淺就可以確定鎘的濃度。儀器和試劑鎘試劑

氫氧化鉀

乙醇；定量濾紙；0.1%鎘試劑的氫氧化鉀乙醇溶液

（取0.1克鎘試劑，加0.125mol/L氫氧化鉀乙醇溶液，溶解，并稀釋至100mL）二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測(cè)方法研究試紙制作方法

配置0.1%鎘試劑的氫氧化鉀乙醇溶液，將定量分析用濾紙剪成0.6cm寬的試紙條，充分浸泡后自然晾干，備用。使用時(shí)，剪成0.6×0.8cm試紙片。試紙使用方法

取10ml待測(cè)樣品，置15ml刻度試管中，用氫氧化鉀（10mol/l）調(diào)節(jié)（約6~7滴）pH值約為7.0，從試紙瓶中快速取出一條鎘檢測(cè)試紙浸入上述樣品溶液中，5秒后取出，檢視。

與標(biāo)準(zhǔn)色階比較，即可對(duì)樣品中鎘含量進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)。二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測(cè)方法研究標(biāo)準(zhǔn)系列色階的制備

取鎘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/ml）適量，分別加3%HNO3稀釋并配制成0.0、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0μg/mlCd2+標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，檢驗(yàn)。黃色橘紅色測(cè)定步驟*取中藥材粉碎（粗粉）或者剪成小碎片，取約2g精密稱(chēng)定于50mL錐形瓶中，加20mL3%HCl，振搖5min，靜置。（同時(shí)作試劑空白）*取上清液10mL和試劑空白液按上述方法進(jìn)行測(cè)定，之后與標(biāo)準(zhǔn)色階或者隨行對(duì)照溶液顏色比較。*完成一次檢驗(yàn)周期耗時(shí)僅為15~20分鐘二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測(cè)方法研究紙片浸入反應(yīng)時(shí)間的選擇

同時(shí)將六片試紙片浸于5.0μg/mlCd2+溶液中，分別在5s、10s、20s，30s，40s，50s后取出觀察顏色深淺由試驗(yàn)可知，鎘與鎘試劑的反應(yīng)是迅速的，因此只要紙片在溶液中浸透以保證顯色均勻即可，我們選擇了5s的反應(yīng)時(shí)間。二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測(cè)方法研究紙片取出最佳檢視時(shí)間的選擇

將紙片從溶液中取出后置于白色底板上，記錄放置不同時(shí)間后顏色的變化及色階情況，實(shí)驗(yàn)所用鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為1.0μg/ml、3.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml。

最佳觀察時(shí)間應(yīng)該在2~10min時(shí)觀察，為節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間我們選擇了放置2min時(shí)觀察顏色。二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測(cè)方法研究結(jié)果與討論1.鎘試紙顏色變化由空白的黃色，轉(zhuǎn)為橘紅色，濃度太低時(shí)，肉眼不太好分辨，考慮到本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖强焖俸Y選，因此我們認(rèn)為本法的最低檢出濃度為0.5μg/ml時(shí)即可滿足實(shí)驗(yàn)要求。2.本試紙片貯藏進(jìn)行了-34℃、室溫、50℃，1~6個(gè)月的考察。結(jié)果表明，該試紙?jiān)诹鶄€(gè)月內(nèi)均可保證有效。3.通過(guò)對(duì)幾十種中藥材中Cd2+含量測(cè)定的研究，認(rèn)為本方法是可行的。個(gè)別藥材如金銀花，紅花等樣品，建議藥材不要粉碎過(guò)細(xì)或者提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取之后馬上測(cè)定，防止色素影響結(jié)果的檢視。4.本研究研制出的鎘試紙主屬性較強(qiáng)，方法操作簡(jiǎn)便快速、靈敏、攜帶方便，是一種比較理想的檢測(cè)試紙，可以用于定性和半定量分析。三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留快速測(cè)定方法隨著近年來(lái)人民生活水品的日益提高，人們對(duì)農(nóng)藥殘留的關(guān)注程度是與日俱增。雖然在這方面國(guó)家已經(jīng)頒布了眾多的政策法規(guī)來(lái)規(guī)范農(nóng)藥的使用，出臺(tái)了各類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行監(jiān)管，同時(shí)檢驗(yàn)儀器的推陳出新不斷提高農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)的靈敏度。但是在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控方面還有著許多的不足。我們之所以選擇有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥作為檢驗(yàn)的方向。是因?yàn)樯鲜鰞煞N農(nóng)藥現(xiàn)今適用范圍廣；毒性大；且屬于急性中毒性反應(yīng)。三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留快速測(cè)定方法方法原理：膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍(lán)色），有機(jī)磷或氨基甲酸脂類(lèi)農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過(guò)程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的存在。試劑及試藥

固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（速測(cè)卡）；磷酸氫二鈉；無(wú)水磷酸二氫鉀；乙酸乙酯；pH7.5磷酸氫二鈉緩沖溶液；PR-3測(cè)定儀

下面將分有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥兩個(gè)方面進(jìn)行說(shuō)明三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留快速測(cè)定方法對(duì)照溶液的考察

以對(duì)硫磷為代表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用緩沖溶液依次稀釋即得（一）有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)色階藍(lán)白三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留快速測(cè)定方法供試品溶液制備

第一法

取中藥材樣品適量，搗碎成粗粉稱(chēng)取1.0g放入帶蓋塞瓶中，加入10mL緩沖溶液，振搖，靜置片刻，取上清液備用（適用于一般樣品）。

第二法

取中藥材樣品適量，搗碎成粗粉，稱(chēng)取1.0g樣品放入帶蓋瓶中，加入10mL乙酸乙酯，超聲3分鐘，靜置，取上清液過(guò)活性炭小柱，取濾液2mL于50℃水浴蒸至近干，加1mL緩沖溶液溶解，備用（適用于色素含量較高的樣品）。（一）有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留快速測(cè)定方法測(cè)定

取一片速測(cè)卡，在白色藥片上滴2～3滴供試品溶液，放置10min進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，（有條件時(shí)在37℃±2℃恒溫裝置中放置10min，預(yù)反應(yīng)后的反應(yīng)表面必須保持濕潤(rùn)）然后將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏3min（或用恒溫裝置恒溫3min），使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)。之后觀察白色藥片的顏色變化。注：每批次測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖溶液的空白對(duì)照卡。完成一次檢驗(yàn)周期耗時(shí)僅為20~30分鐘（一）有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留快速測(cè)定方法中藥材中添加農(nóng)藥的回收試驗(yàn)的考察*取麥冬粗粉樣品數(shù)份，并按某一系列濃度對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)照品添加。按第一法制備（一）有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥*取紅花粗粉數(shù)份，并按某一系列濃度對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)照品添加。按第二法制備。對(duì)照溶液的情況考察

稱(chēng)取對(duì)照品抗蚜威5mg和克百威5mg于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度?？偘被姿狨ヮ?lèi)農(nóng)藥濃度為100μg/mL。三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留快速測(cè)定方法（二）氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥藍(lán)白三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留快速測(cè)定方法

供試品溶液配制及測(cè)定，同前文有機(jī)磷測(cè)定中藥材中添加農(nóng)藥的回收情況考察

取麥冬粗粉樣品數(shù)份，并按某一系列濃度對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)照品添加。按第一法制備（二）氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥

取銀杏葉粗粉數(shù)份，并按某一系列濃度對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)照品添加。按第二法制備。三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留快速測(cè)定方法

樣品測(cè)定

根據(jù)中藥的莖、根、葉、花、果等分類(lèi)，選取了有代表性的幾十種中藥材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如黃芪、紅花、金銀花、銀杏葉等。按方法一、二法制備供試液，測(cè)定。結(jié)果

所有參與實(shí)驗(yàn)的中藥材檢測(cè)結(jié)果都呈陰性，未檢出有機(jī)磷或者氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯