NY/T 678-2003豬偽狂犬病免疫酶試驗(yàn)方法

犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

犖犢／犜６７８—２００３

豬偽狂犬病免疫酶試驗(yàn)方法

犈狀狕狔犿犲犻犿犿狌狀狅犪狊狊犪狔犳狅狉狆狅狉犮犻狀犲狆狊犲狌犱狅狉犪犫犻犲狊

２００３０７３０發(fā)布２００３１００１實(shí)施

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布

書

犖犢／犜６７８—２００３

前言

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ是規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王宏偉、吳清民、童光志、田克恭、陳西釗、蘇敬良、王傳彬。

Ⅰ

書

犖犢／犜６７８—２００３

豬偽狂犬病免疫酶試驗(yàn)方法

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬偽狂犬病Ｅ糖蛋白（ｇＥ，即ｇｐⅠ）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫酶組織化學(xué)試驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測(cè)豬血清中的豬偽狂犬病病毒ｇＥ特異性抗體和組織中的豬偽狂犬病病毒抗原。

２犈糖蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（犵犈犈犔犐犛犃）

２．１材料準(zhǔn)備

２．１．１試劑

ａ）ＥＬＩＳＡ抗原包被板；

ｂ）標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：偽狂犬病病毒ｇＥ單克隆抗體；

ｃ）標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：無(wú)偽狂犬病病毒ｇＥ抗體的豬血清；

ｄ）酶結(jié)合物：辣根過(guò)氧化物酶（ＨＲＰ）標(biāo)記的抗偽狂犬病病毒ｇＥ單克隆抗體；

ｅ）磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ）：配制見(jiàn)第Ａ．１章；

ｆ）洗滌液：配制見(jiàn)第Ａ．２章；

ｇ）樣品稀釋液：配制見(jiàn)第Ａ．３章；

ｈ）底物溶液：配制見(jiàn)第Ａ．５章；

ｉ）終止液：配制見(jiàn)第Ａ．６章。

２．１．２器材

ａ）酶聯(lián)檢測(cè)儀；

ｂ）微量加樣器，容量５０μＬ～２００μＬ；

ｃ）３７℃恒溫培養(yǎng)箱。

２．１．３樣品

采集被檢豬血液，分離血清，血清應(yīng)新鮮、透明、不溶血、無(wú)污染，密裝于滅菌小瓶?jī)?nèi)，４℃或－３０℃保

存或立即送檢。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào)，并用樣品稀釋液作２倍稀釋。

２．２操作方法

２．２．１取出包被板，并將樣品位置準(zhǔn)確記錄在記錄單上。

２．２．２向Ａ１、Ａ２、Ａ３孔中分別加入１００μＬ未經(jīng)稀釋的陰性對(duì)照血清，Ａ４、Ａ５、Ａ６孔中分別加入

１００μＬ未經(jīng)稀釋的陽(yáng)性對(duì)照血清，其他各孔加入１００μＬ稀釋好的待檢樣品。

２．２．３置室溫１ｈ。

２．２．４棄去孔內(nèi)液體，再在紗布或吸水紙上拍干。

２．２．５用洗滌液將反應(yīng)板洗滌（３～５）次，每次洗滌后均棄去孔內(nèi)液體。最后一次洗滌后，除凈孔內(nèi)液

體，拍干。

２．２．６每孔加入１００μＬ酶結(jié)合物溶液，室溫下作用２０ｍｉｎ。

２．２．７重復(fù)２．２．４和２．２．５。

２．２．８各孔加入１００μＬ底物液。

２．２．９室溫放置１５ｍｉｎ。

２．２．１０各孔加入５０μＬ終止液，立即用酶標(biāo)儀于６５０ｎ