孕婦艾滋病、梅毒和乙肝檢測技術(shù)

孕婦艾滋病、梅毒和乙肝檢測技術(shù)

前言

對于我們醫(yī)務(wù)工作者在醫(yī)療活動中針對符合一定條件的就診者提供艾滋病和梅毒、乙肝的檢測，我們稱之為“篩查”。篩查是預(yù)防艾滋病和梅毒、乙肝的一項重要策略，為世界衛(wèi)生組織和我國所倡導(dǎo)。它的目的是早期發(fā)現(xiàn)感染者，及早得到診斷和治療，達到治愈感染者、消除傳染源、阻斷進一步傳染的目的。同時，這種篩查也是“有的放矢”的，它是針對特定的人群、特定的情況而進行的，并非亂檢查、亂收費。傳染病傳染過程：病原體侵入病原體與機體相互作用與斗爭結(jié)局隱性感染病原攜帶顯性感染

死亡宿主病原體被清除3傳染病傳播的基本條件

三個基本環(huán)節(jié)：傳染源易感人群傳播途徑45傳染病的流行過程

傳染源

自然和社會因素傳播途徑易感人群6潛伏期傳染期病原侵入排出病原體出現(xiàn)癥狀時間過程潛伏期停止排出病原體（痊愈、死亡等）傳染期7

傳染病種類繁多，為了保障公眾的健康與安全，國家以法律的形式將某些傳染病列為法定傳染病以加強管理。

2004年新頒布的《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定了甲類、乙類和丙類共37種法定傳染病。其中：

1、甲類傳染病2種：鼠疫、霍亂

法定傳染病8

乙類傳染病25種：傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質(zhì)炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、登革熱、炭疽、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯氏菌病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾。(其中傳染性非典型肺炎、炭疽中的肺炭疽和人感染高致病性禽流感按甲類管理。)

9艾滋病和梅毒、乙肝離我們遠嗎？

艾滋病和梅毒、乙肝是一種危害性極大的傳染病，尤其是近年來,我國艾滋病和梅毒、乙肝感染者和病人呈逐年上升趨勢，從2005年的0.4%上升到2017年的21.45%；并從高危人群向一般人群擴散,通過母嬰傳播途徑感染的比例也在增加。若不采取預(yù)防干預(yù)措施，感染了艾滋病和梅毒、乙肝病毒的母親，生下染有艾滋病和梅毒、乙肝病毒嬰兒的比例很大,嚴重威脅著廣大婦女和兒童的健康。因此,預(yù)防艾滋病和梅毒、乙肝母嬰傳播是保護兒童免遭艾滋病和梅毒、乙肝侵害、減少兒童感染艾滋病和梅毒、乙肝的重要措施，這就需要我們提高警惕，認識到艾滋病感染的危險性，而接受專業(yè)人員的咨詢和篩查是有效的解決途徑。艾滋病、梅毒、乙肝--概況

母嬰傳播途徑1、艾滋病：約15～35%

HIV陽性孕婦會發(fā)生母嬰傳播。90%以上兒童HIV感染者是由母親垂直傳播而感染。2、梅毒：流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或馬鞍鼻、先天性耳聾等。3、乙肝：在我國，人群中40-50%是由母嬰傳播積累而成。

介紹相關(guān)檢測技術(shù)一.艾滋病實驗室檢測技術(shù)HIV抗體檢測核酸檢測CD4+T淋巴細胞檢測二.梅毒檢測技術(shù)顯微鏡檢查法血清學(xué)檢查法三.乙肝檢測技術(shù)HBV免疫標志物檢測HBV-DNA

檢測時要注意什么？

作為受檢者，應(yīng)該注意的是：一是要向醫(yī)生提供較為詳盡的病史，特別是危險的性行為，不要因為不好意思而隱瞞。只有這樣，醫(yī)生才能正確判斷感染的危險性，有助于分析檢測結(jié)果并做出診斷和處理的決斷。二是注意檢測的“窗口期”問題，也就是從病原體進入人體到血液中產(chǎn)生足夠量的、能用檢測方法查出抗體的這段時期。對于艾滋病“窗口期”，隨著新一代、敏感的艾滋病抗體檢測手段出現(xiàn)后，艾滋病窗口期已經(jīng)縮短到最為保守的艾滋病抗體峰值出現(xiàn)的第6周。就目前廣泛采用的第三、四代雙原夾心法和酶聯(lián)法以及化學(xué)發(fā)光法等檢測手段而言，艾滋病的窗口期可以縮短到14～21天。而梅毒雖無“窗口期”說法，但從感染到可檢測到抗體也需要3～4周甚至更長時間。因此，在有高危的性行為后接受檢測，結(jié)果雖為陰性但未渡過“窗口期”，仍不可掉以輕心，需要繼續(xù)隨訪直到確認已渡過“窗口期”。三是結(jié)果的解釋和分析要聽從醫(yī)生的專業(yè)建議。艾滋病、梅毒檢測結(jié)果的意義隨受檢者不同的情況而有差別。因此受檢者應(yīng)該聽從醫(yī)生對結(jié)果的解釋和建議，不可盲目悲觀或盲目樂觀。乙肝，丙肝，梅毒，艾滋檢測的必要性

艾滋病、梅毒、乙肝實驗室檢測技術(shù)艾滋病抗體檢測及

樣品處理實驗室質(zhì)量管理生物安全質(zhì)量控制梅毒乙肝

檢測要點檢測技術(shù)一、艾滋病檢測技術(shù)HIV抗體檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）核酸檢測CD4+T淋巴細胞檢測快速檢測（RT）（建議配備合格的快速檢測試劑，灰區(qū)。）HIV抗體檢測試劑有國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準文號試劑在有效期內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑應(yīng)批批檢合格證件采購試劑選擇敏感性和特異性高的試劑HIV抗體篩查樣品血清/血漿/全血濾紙干血斑唾液尿液一般篩查方法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗：采用發(fā)光或熒光底物，用發(fā)光或熒光儀測定結(jié)果。快速檢測（RT）及其它檢測試驗

(1)明膠顆粒凝集試驗(PA)(2)免疫滲濾試驗

(3)免疫層析試驗(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）HIV抗體檢測試劑：檢測HIV-1/2抗體HIV抗原抗體聯(lián)合檢測試劑：可同時檢測血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗體用酶標儀測定結(jié)果四代艾滋病酶聯(lián)免疫試劑比較solidphasespecificdetectionofconjugate第一代病毒裂解液HIV-1IgG抗體HIV-1-IgG抗體第二代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2IgG抗體HIV-1/-2IgG抗體第三代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-OIgM/IgG抗體HIV-1/-2/-O病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-O第四代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24AbIgM/IgG抗體HIV-1/-2/-Op24抗原病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗體ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗

ELISAHIV抗原包被平板病人抗體酶顯色劑+ve-ve陰性對照陽性對照陰性陽性質(zhì)控酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）優(yōu)點：準確性高、價格低廉、判斷結(jié)果標準客觀、結(jié)果便于記錄和保存用途：流行病學(xué)監(jiān)測及臨床大量標本的檢測(2)化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗采用發(fā)光或熒光底物既可檢測抗體，也可聯(lián)合檢測抗原抗體酶或熒光標記的HIV抗原或抗體，加發(fā)光或熒光底物用發(fā)光儀或熒光儀測定結(jié)果全血樣品加50ul樣品于樣品墊中手指血方法靜脈血方法加一滴緩沖液15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果（3）快速檢測（RT）及其它檢測試驗快速檢測（RT）及其它檢測試驗優(yōu)點:試驗簡便快速，適用于應(yīng)急檢測、門診急診檢測。不需專門設(shè)備和人員培訓(xùn),一般可在10～30分鐘內(nèi)得出結(jié)果。缺點:肉眼判斷較主觀、價格較貴、結(jié)果不易保存。樣品初篩試驗一陰一陽均陽性反應(yīng)報告陰性確證試驗復(fù)檢試驗報告陰性均陰性反應(yīng)陽性反應(yīng)原有試劑＋另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑選用篩查試劑陰性反應(yīng)HIV抗體篩查檢測流程圖HIV抗體確證試驗確證試驗的試劑：必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準、在有效期內(nèi)的試劑。確證樣品：可采用血清、血漿、濾紙干血斑確證試驗方法：免疫印跡試驗(WB)、條帶免疫試驗(LIATEKHIVⅢ)、放射免疫沉淀試驗(RIPA)及免疫熒光試驗(IFA)。國內(nèi)常用的確證試驗方法是WB。HIV抗體確證實驗結(jié)果a強陽性對照（HIV-1和HIV-2）b弱陽性對照（HIV-1）c陰性對照d典型的HIV-2血清陽性反應(yīng)abcdgp160gp120p66p55p51gp41p39p31P24p17

血清對照HIV-2特異帶初篩檢測陽性標本兩種篩查試劑報告陰性陰性反應(yīng)一陰一陽陽性反應(yīng)確證試劑復(fù)檢試驗根據(jù)具體情況進一步檢測HIV-2報告陰性出現(xiàn)HIV-2指示條帶陰性反應(yīng)不確定反應(yīng)報告HIV-1陽性HIV-1陽性反應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)資料，可以在4周后隨訪檢測，如帶型沒有進展或呈陰性反應(yīng)，則報告陰性；如隨訪期間出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則報告陽性；如隨訪期間帶型有進展，但不滿足陽性標準，應(yīng)繼續(xù)隨訪到8周。如帶型沒有進展或呈陰性反應(yīng)則報告陰性；滿足HIV抗體陽性診斷標準則報告陽性，不滿足陽性判斷標準可視情況決定是否繼續(xù)隨訪。HIV抗體確證檢測流程圖實驗室需備有：1～2種HIV-1/2抗體ELISA（化學(xué)發(fā)光）試劑2種HIV-1/2抗體快速試劑百度網(wǎng)每年進行體外診斷試劑評估如：“HIV抗體試劑臨床評估”HIV抗體母親HIV抗體經(jīng)胎盤進入胎兒，出生時新生兒和嬰兒早期抗體陽性，不一定是感染出生時母親的抗體，80~90%在生后9~12個月消失，出生后18個月基本上全部消失18個月后兒童HIV抗體仍然陽性，視為自身感染產(chǎn)生的抗體18個月以下嬰幼兒的HIV診斷嬰幼兒HIV感染的抗體檢測適用于：HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒；母親HIV感染狀態(tài)不詳，兒童出現(xiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床懷疑HIV感染的兒童。嬰兒12個月時進行HIV抗體檢測

陰性排除感染，納入正常兒童保??；

陽性者繼續(xù)追蹤隨訪，至18個月再次進行HIV抗體檢測，結(jié)果陰性排除感染。艾滋病病毒感染產(chǎn)婦所生兒童陽陰用另一種不同原理或不同廠家生產(chǎn)的篩查試劑再次檢測12個月進行HIV抗體篩查試驗確證試驗18個月時再進行HIV抗體篩查試驗報告HIV抗體檢測結(jié)果陰性艾滋病感染產(chǎn)婦所生兒童HIV抗體檢測流程陽性陰性陰性陽性用另一種不同原理或不同廠家生產(chǎn)的篩查試劑再次檢測陰性陰性陽性報告HIV抗體檢測結(jié)果陽性提供咨詢，繼續(xù)隨訪，4周后再次進行確證試驗不確定陽性18個月以下嬰幼兒的HIV診斷核酸檢測HIV前病毒DNA（HIVDNA）檢測已整合到外周血液中血細胞基因組上的HIVDNA基于PCR技術(shù)高特異度(98%)和高靈敏度(>99%)18個月以下嬰幼兒的HIV診斷HIV病毒載量（HIVRNA）用來監(jiān)測已知的HIV感染病人的病毒載量試驗；真陽性的結(jié)果通常>100,000拷貝/毫升,而假陽性結(jié)果<1,000拷貝/毫升RT-PCR、NASBA、CDNA、熒光定量PCR嬰幼兒HIV感染的核酸檢測可檢測HIVRNA也可檢測HIVDNA首選檢測HIVDNAHIVDNA檢測不受母親圍產(chǎn)期抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療和人乳汁中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物以及嬰幼兒預(yù)防性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的干擾考慮母親血液污染因素，不推薦使用臍帶血進行HIV核酸檢測

。嬰兒的早期診斷

HIV感染母親所生小于18個月齡的嬰兒，不同時間的兩次HIV核酸檢測均為陽性即可作出診斷。18個月齡以上兒童診斷與成人相同：有急性HIV感染綜合癥或流行病學(xué)史，且不同時間的兩次HIV核酸檢測結(jié)果均為陽性，即可診斷。

HIV感染產(chǎn)婦所生嬰兒嬰兒滿3個月，再次采集血標本，送檢盡快采集第二份血標本，送檢出生后6周采集第一份血標本（可制備成濾紙片干血斑（DBS），或EDTA抗凝全血），送檢繼續(xù)隨訪報告陽性產(chǎn)婦所生兒童HIV感染早期診斷檢測流程呈陰性反應(yīng)呈陽性反應(yīng)呈陽性反應(yīng)呈陰性反應(yīng)呈陽性反應(yīng)盡快再次采集血樣，送檢報告陰性呈陽性反應(yīng)呈陰性反應(yīng)呈陰性反應(yīng)嬰幼兒HIV感染的核酸檢測需要注意：不同時間“嬰兒HIV感染早期診斷”檢測均呈陰性反應(yīng)的喂哺母乳的兒童，應(yīng)在完全停止喂哺母乳后的6周和3個月（若6周時檢測結(jié)果為陽性可盡快）再次采血進行核酸定性檢測。兒童滿18個月后則可直接進行抗體檢測。嬰幼兒HIV感染的核酸檢測方法

HIV-DNA1）RocheAmplicor試劑盒2）IN-HOUSE（國內(nèi)開展，2009年檢測技術(shù)規(guī)范）AmplicorHIV-1DNA簡介樣本：濾紙片干血斑、EDTA抗凝全血方法學(xué)：PCR-ELISA結(jié)果類型：定性靶物質(zhì)：感染宿主細胞中的pro-viralHIV-1DNA濾紙片干血斑將全血滴在特定的濾紙片上制備。它主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中新生兒先天性缺陷疾病的早期篩查。如：苯丙酮尿癥，先天性甲狀腺機能低下，維生素缺乏和一些感染性疾病的檢測。

濾紙片干血斑用于嬰兒HIV診斷樣本量非常小，(20lto200l)特別適宜采集嬰兒樣本。容易收集: 指尖血、后跟血。能提取全血，血漿、血清。短期運輸可在常溫下長期可貯存在–20C樣本可在常溫下運輸:不需要干冰DBS可作為一種無感染性材料運輸（在美國）濾紙片的選擇

Whatman903濾紙片（可用于HIV抗體、HIV前病毒DNA和HIVRNA檢測）FTA標準卡濾紙片（可用于HIV前病毒DNA檢測）采集樣本所需要的材料血樣本采集卡片(濾紙片)；可密封的塑料袋；濕度指示卡；干燥劑（1-2g/袋）；怎樣采集末梢血DBS應(yīng)用通用的安全防護措施；清晰準確地在卡片上標記識別碼；完成針刺指尖程序；均一地使每個印圈飽和地吸附血液；

兩個充分吸附血液的印圈比五個不完全吸附的印圈要好怎樣采集抗凝靜脈血DBS靜脈血充分與EDTA混合；最好采集后立即制備干血斑；血漿與血細胞分層的全血在制備干血斑前，應(yīng)輕柔地上下顛倒采血管（避免血細胞破裂），使血液混勻后制備；用移液槍加代濾芯槍頭移取75-80ul血液；槍頭對準印圈的中心緩慢將血液滴于濾紙上；避免有氣泡；怎樣干燥DBS避免觸摸或涂抹血斑；室溫空氣中水平干燥（至少4個小時）；避免陽光直曬；在干燥過程中不允許加熱，疊加或?qū)BS接觸其他表面；在包裝前充分干燥DBS濾紙片干血斑的包裝與運輸將完全干燥的濾紙片干血斑樣本用塑料袋進行獨立包裝，或者用秤量紙隔開，以避免樣本之間的污染。已獨立包裝好的樣本一起放入密封塑料袋中，加入幾包干燥劑,加入濕度指示卡。將包裝好的濾紙片干血斑，連同相應(yīng)的文件（如采樣/送樣單等）放入大信封中。密封后可郵寄運輸。放入密封袋加入干燥劑加入濕度指示卡標記袋中內(nèi)容物核酸檢測2次檢測陽性可早期診斷HIV感染，如果不具備條件，也可用HIV病毒載量法來代替，2次檢測陽性也可診斷HIV感染，18個月齡以后再做抗體檢測確認。

HIV核酸定量檢測

通過SFDA審批的試劑盒、方法

NASBAEasyQAmplicorTaqmanbDNA340440M2000PGCD4+T淋巴細胞檢測CD4+T淋巴細胞計數(shù)廣泛應(yīng)用于HIV感染者的臨床管理中，協(xié)助判斷感染者的預(yù)后、指導(dǎo)實施抗病毒治療和療效觀察以及藥物預(yù)防機會性感染等方面。CD4+T淋巴細胞檢測對于免疫功能相對較好，CD4+T淋巴細胞計數(shù)>350/mm3的艾滋病感染孕產(chǎn)婦，采用預(yù)防性抗病毒用藥方案；對于CD4+T淋巴細胞計數(shù)≤350/mm3的艾滋病感染孕產(chǎn)婦，采用治療性抗病毒用藥方案。常規(guī)CD4+T淋巴細胞檢測的方法和程序

流式細胞儀檢測方法雙平臺方法單平臺方法樣品：EDTA、枸櫞酸（ACD）或肝素抗凝全血運送條件：室溫（18～25℃）保存和運輸樣品避免極端溫度（結(jié)冰或大于37℃）高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝樣品，并將其置于有冰袋和吸熱物質(zhì)的容器中。常規(guī)CD4+T淋巴細胞檢測的方法和程序48小時內(nèi)染色，染色后6小時內(nèi)分析；如采血后24小時內(nèi)染色，可在染色后24小時內(nèi)分析；利用CD45單克隆抗體設(shè)淋巴細胞門，可檢測放置72小時的樣品；在血球分析儀生產(chǎn)商允許的樣品采集時間范圍內(nèi)檢測。FACSCalibur流式細胞儀二、梅毒檢測技術(shù)顯微鏡檢查法血清學(xué)檢查法梅毒特異性抗原血清學(xué)檢測梅毒非特異性抗原血清學(xué)檢測各期梅毒的取材部位和檢查方法臨床表現(xiàn)取材部位檢查方法一期梅毒潰瘍、淋巴結(jié)暗視野檢查血液血清學(xué)檢查二期梅毒皮損、淋巴結(jié)暗視野檢查血液血清學(xué)檢查三期梅毒血液、腦脊液血清學(xué)檢查隱性梅毒血液血清學(xué)檢查胎傳梅毒皮損、胎盤暗視野檢查血液血清學(xué)檢查（一)、顯微鏡檢查法1.暗視野顯微鏡檢查2.直接免疫熒光試驗（DFA）3.渡銀染色檢查1.暗視野顯微鏡檢查暗視野顯微鏡下，典型的梅毒螺旋體呈白色發(fā)光,其螺旋較密而均勻。運動規(guī)律，運動性較強，其運動方式包括①旋轉(zhuǎn)式，圍繞其長軸旋轉(zhuǎn)；②蛇行式,全身彎曲如蛇行；③伸縮其螺旋間距離而移動。觀察其運動形式有助于與其他螺旋體相鑒別。未檢出螺旋體不能排除梅毒的診斷，陰性結(jié)果可能說明：①螺旋體數(shù)量不足(單次暗視野顯微鏡檢查陽性率小于50%)。②患者已接受抗生素或殺滅梅毒螺旋體的藥物治療。③損害接近自然消退。④損害不是梅毒。2.直接免疫熒光試驗（DFA)在熒光顯微鏡下可見到發(fā)蘋果綠色的梅毒螺旋體。臨床意義與暗視野顯微鏡檢測相同。DFA的特異性及敏感性均大于暗視野顯微鏡檢測。3.梅毒螺旋體渡銀染色檢查梅毒螺旋體具有親銀性，顯微鏡下可見到染成棕色的梅毒螺旋體。臨床意義基本同暗視野顯微鏡檢查法。(二)、血清學(xué)檢查法血清學(xué)檢查是輔助診斷梅毒的重要手段。當人體感染梅毒螺旋體后4～10周左右，血清中可產(chǎn)生一定數(shù)量的抗類脂質(zhì)抗原的非特異性反應(yīng)素（主要是IgM、IgG）和抗梅毒螺旋體抗原的特異性抗體（主要是IgM、IgG）。這些抗體均可用免疫學(xué)方法進行檢測。梅毒血清學(xué)檢測方法1.非梅毒螺旋體抗原血清試驗1.1性病研究實驗室試驗（VenerealDiseaseResearchLaboratorytest，VDRL）1.2快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（Rapidplasmareagincirclecardtest，RPR）1.3甲苯胺紅試驗（Toluidineredunheatedserumtest，TRUST）方法簡便、快速，敏感性和特異性較好。對一期梅毒的敏感性為74％～87％，二期梅毒達100％，三期梅毒34％～94％。特異性96％～99％。非梅毒螺旋體抗原血清試驗臨床意義適用于各期梅毒的診斷。早期梅毒經(jīng)治療后血清滴度可下降或轉(zhuǎn)陰，故可用于療效觀察、判愈、判定復(fù)發(fā)或再感染。也適用于人群的篩查、產(chǎn)前檢查及健康體檢等。VDRL試驗適用于神經(jīng)梅毒的腦脊液檢查,特異性高，但敏感性低?？稍谀承﹤魅静〖澳z原病時出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，因此對陽性反應(yīng)應(yīng)結(jié)合臨床進行鑒別，或做梅毒螺旋體抗原血清試驗以進一步證實之。2.梅毒螺旋體抗原血清試驗

采用梅毒螺旋體作抗原，為特異性抗原，檢測血清中抗梅毒螺旋體IgG或IgM抗體。敏感性和特異性均較高。一期梅毒的敏感性為70％～100％，二期梅毒達100％，三期梅毒95％～98％，特異性94％～100％。梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）原理

TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒，此致敏顆粒與人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)。明膠顆粒為玫瑰紅色，便于肉眼觀察結(jié)果。梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸