流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法及應(yīng)用講解學(xué)習(xí)

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法(fāngfǎ)及應(yīng)用第一頁(yè)，共77頁(yè)?？蒲行头诌x功能(gōngnéng)488nm激光四色熒光(525、575、610、675nm）第二頁(yè)，共77頁(yè)。一、流式細(xì)胞術(shù)的原理(yuánlǐ)流式細(xì)胞儀的發(fā)展起源于細(xì)胞計(jì)數(shù)自動(dòng)化的研究。其原理是被熒光染色的單細(xì)胞或顆粒，經(jīng)過高速的液流系統(tǒng)形成細(xì)胞柱，排列成單細(xì)胞依次通過(tōngguò)流動(dòng)室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒光素細(xì)胞受激發(fā)產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)，這些熒光信號(hào)可以反映細(xì)胞的生物特性。第三頁(yè)，共77頁(yè)。前向散射(sǎnshè)激光(jīguāng)第四頁(yè)，共77頁(yè)。FCM的液流系統(tǒng)（如何(rúhé)形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本(yàngběn)管鞘液管第五頁(yè)，共77頁(yè)。

近30年來流式細(xì)胞術(shù)在我國(guó)得到很快的發(fā)展，應(yīng)用范圍不斷增大。目前，流式細(xì)胞術(shù)作為一門生物檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)(shēnɡwùhuàxué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。第六頁(yè)，共77頁(yè)。速度(sùdù)快極短時(shí)間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，每秒可檢測(cè)上萬個(gè)細(xì)胞，甚至幾萬個(gè)細(xì)胞。多參數(shù)分析可同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多種特性，獲得單個(gè)細(xì)胞多種信息，也可以根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)志的不同把細(xì)胞群分為各亞群。二、流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)(tèdiǎn)、優(yōu)點(diǎn)第七頁(yè)，共77頁(yè)。定性、定量分析細(xì)胞(xìbāo)通過熒光染色對(duì)單細(xì)胞(xìbāo)的某些成分，如：DNA、抗原或受體等進(jìn)行定性、定量分析。靈敏度高熒光能檢測(cè)到單個(gè)微粒上標(biāo)有熒光分子少于<600個(gè)(如FITC或PE)；前向角檢測(cè)到小于0.3um顆粒。分選感興趣的細(xì)胞(xìbāo)純度達(dá)99%，收獲率可達(dá)90%。第八頁(yè)，共77頁(yè)。流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍細(xì)胞大小細(xì)胞表面分子:CD系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測(cè):細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡其他(qítā)：線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度第九頁(yè)，共77頁(yè)。常用(chánɡyònɡ)熒光素激發(fā)光波長(zhǎng)（nm）

發(fā)射波長(zhǎng)(nm)異硫氰酸（FITC）488525（綠）藻紅蛋白（PE）488575（橙）碘化丙啶（PI）488610（紅）藻紅蛋白偶聯(lián)物（PE-CY5）488667（紅）藻紅蛋白偶聯(lián)物（PE-CY7）488767（紅外）別藻青蛋白（APC）633660（紅）別藻青蛋白偶聯(lián)物（APC-CY7）633767（紅外）三、單克隆抗體(kàngtǐ)標(biāo)記熒光探針選擇1.了解激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)第十頁(yè)，共77頁(yè)。

2.要有高的光子(guāngzǐ)產(chǎn)量---提高信號(hào)強(qiáng)度。3.對(duì)激光有強(qiáng)的吸收----降低背景噪音。4.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間差距大---減少干擾。5.易與被標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合，而不影響被標(biāo)記物的特異性。6.穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、標(biāo)本抗凝劑和固定劑等影響。第十一頁(yè)，共77頁(yè)。細(xì)胞表型分析(fēnxī)：雙色分析(fēnxī)：FITC與PE三色分析(fēnxī)：雙色分析(fēnxī)+PE-CY5四色分析(fēnxī)：三色分析(fēnxī)+ECDDNA含量分析(fēnxī)：PI凋亡與壞死分析(fēnxī)：凋亡用AnnexinV-FITC/PI雙染常用熒光探針(tànzhēn)組合第十二頁(yè)，共77頁(yè)。四、標(biāo)本的收集、單細(xì)胞懸液的制備(zhìbèi)骨髓、外周血、細(xì)胞株、組織器官、胸水、腹水、尿液脫落細(xì)胞等

第十三頁(yè)，共77頁(yè)。1、骨髓及外周血細(xì)胞(xìbāo)單細(xì)胞(xìbāo)懸液的制備

骨髓及外周血都是天然的單個(gè)細(xì)胞(xìbāo)，可直接標(biāo)記，再溶血。單細(xì)胞的分離制備分離液血液+生理鹽水離心(líxīn)2500r/min，20-30min單個(gè)核細(xì)胞第十四頁(yè)，共77頁(yè)。單核細(xì)胞:利用單核細(xì)胞在短時(shí)培養(yǎng)(péiyǎng)貼壁快的特性（30-40min），可采用短時(shí)培養(yǎng)獲得較純的單核細(xì)胞.第十五頁(yè)，共77頁(yè)。2、培養(yǎng)細(xì)胞樣品的制備(zhìbèi)(貼壁細(xì)胞)培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)液PBS洗2次胰蛋白酶37℃，室溫，3-5min含血清的培養(yǎng)基吹打PBS洗2次單細(xì)胞懸液。第十六頁(yè)，共77頁(yè)。3.組織器官單細(xì)胞懸液的制備酶消化(xiāohuà)法

組織器官單細(xì)胞制備儀剪碎法機(jī)械法網(wǎng)搓法研磨法

第十七頁(yè)，共77頁(yè)。（1）、酶消化法組織塊洗去血液剪成小塊胰蛋白酶37℃，15-30min含血清的培養(yǎng)基100目鋼篩網(wǎng)過濾(guòl(fā)ǜ)300目尼龍網(wǎng)過濾(guòl(fā)ǜ)離心1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液。第十八頁(yè)，共77頁(yè)。（2）、機(jī)械法單細(xì)胞制備儀組織塊洗去血液剪成小塊制備儀2-3min100目鋼篩網(wǎng)過濾300目尼龍網(wǎng)過濾離心(líxīn)1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液。剪碎法組織塊洗去血液剪至漿狀吸管輕輕吹打100目鋼篩網(wǎng)過濾300目尼龍網(wǎng)過濾離心(líxīn)1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液。

第十九頁(yè)，共77頁(yè)。

網(wǎng)搓法組織塊洗去血液(xuèyè)100目鋼篩網(wǎng)輕搓生理鹽水收集濾液300目尼龍網(wǎng)過濾離心1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液。研磨法組織塊洗去血液(xuèyè)研磨器研至勻漿100目鋼篩網(wǎng)300目尼龍網(wǎng)過濾離心1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液。第二十頁(yè)，共77頁(yè)。4.石蠟(shílà)包埋組織單細(xì)胞懸液的制備

醇乙脫水(tuōshuǐ)：

70％→80%→90％→95%→100%醇乙→二甲苯→石蠟包埋

脫蠟水化：

二甲苯脫蠟→100％醇乙→90%→80%→70％→50％→蒸餾水手術(shù)獲得的新鮮實(shí)體(shítǐ)組織，常要送病理石蠟包埋處理，這些標(biāo)本也可用于流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)。第二十一頁(yè)，共77頁(yè)。石蠟包埋組織制備

單細(xì)胞懸液石蠟包埋組織切片二甲苯脫蠟1-2天水化乙醇(yǐchún)，蒸餾水組織器官胰蛋白酶37℃，15-30min冰PBS100目鋼篩網(wǎng)過濾300目尼龍網(wǎng)過濾離心1000r/min，5minPBS洗2次單細(xì)胞懸液第二十二頁(yè)，共77頁(yè)。5.脫落細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備(zhìbèi)包括：尿液脫落細(xì)胞胸水、腹水脫落細(xì)胞沖洗液脫落細(xì)胞

第二十三頁(yè)，共77頁(yè)。收集胸水、腹水、尿液、沖洗液置4℃冰箱中沉淀(chéndiàn)取底部10-20mlPBS洗3次300目尼龍濾網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液收集方法、沉淀(chéndiàn)時(shí)間胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml肝素液，置于4℃冰箱中靜置6-12h尿液：收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀(chéndiàn)2h沖洗液：300-500ml生理鹽水沖洗膀胱，冰箱內(nèi)置6-12h第二十四頁(yè)，共77頁(yè)。五、熒光標(biāo)記主要包括間接免疫熒光染色和直接免疫熒光染色兩種方法。間接標(biāo)記是采用特異的無熒光標(biāo)記的一抗與待測(cè)標(biāo)本反應(yīng)后，洗去未結(jié)合抗體(kàngtǐ)再加入熒光標(biāo)記的二抗，形成有熒光的抗原--抗體--抗體(kàngtǐ)復(fù)合物。其操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，目前很少用。在科研中需要一些新的抗體(kàngtǐ)沒有直接抗體(kàngtǐ)，只能采用此方法。直接標(biāo)記是在標(biāo)記時(shí)加入連接著熒光素的特異性抗體(kàngtǐ)，該方法簡(jiǎn)單，目前廣泛應(yīng)用于各實(shí)驗(yàn)室。羊抗兔兔抗小鼠小鼠直標(biāo)間標(biāo)第二十五頁(yè)，共77頁(yè)。

根據(jù)細(xì)胞部位的不同，可分為(fēnwéi)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原染色，細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記需要固定、破膜等步驟1.細(xì)胞表面抗原的標(biāo)記法（外周血為例）全血50ul（5×105）+10ul相應(yīng)抗體→避光孵育15-30min→溶血素→室溫10min→PBS洗1次→上機(jī)分析（1%多聚甲醛固定）。第二十六頁(yè)，共77頁(yè)。2.細(xì)胞漿或核內(nèi)抗原標(biāo)記法收集單細(xì)胞懸(1×106)+固定劑A室溫，15min洗滌去固定液破膜劑B及抗體室溫，15minPBS洗滌1次上機(jī)分析(fēnxī)（1%多聚甲醛固定）。3.細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原同時(shí)標(biāo)記在流式分析(fēnxī)中通常需要細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)同時(shí)標(biāo)記，首先標(biāo)記表面抗原，然后再對(duì)細(xì)胞膜和核膜進(jìn)行固定破膜后再標(biāo)記胞內(nèi)或核內(nèi)抗原。常見細(xì)胞破膜劑：0.05%皂角素、0.1%曲拉通(TritonX-100)、70%乙醇、商品化固定破膜劑（A、B）。第二十七頁(yè)，共77頁(yè)。1、空白對(duì)照用緩沖液（PBS）代替單克隆抗體(kàngtǐ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)2、陽(yáng)性染色對(duì)照用現(xiàn)有試劑和方法檢測(cè)已知表達(dá)某種特異性抗原的細(xì)胞即為陽(yáng)性細(xì)胞。如檢測(cè)血小板CD62P時(shí)，可用被ADP誘導(dǎo)活化血小板作為CD62P檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞。六、熒光(yíngguāng)染色對(duì)照設(shè)置(空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、

同型對(duì)照)第二十八頁(yè)，共77頁(yè)。3.陰性染色(rǎnsè)對(duì)照已知不表達(dá)某種抗原的細(xì)胞即為陰性細(xì)胞群，如CD3/CD19雙染檢測(cè)健康人血液淋巴細(xì)胞亞群時(shí)，應(yīng)有一群不表達(dá)這兩種抗原的雙陰性細(xì)胞群（主要是NK細(xì)胞），可作陰性對(duì)照。4.同型對(duì)照與染色(rǎnsè)的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型，如IgG-FITC、IgG-PE第二十九頁(yè)，共77頁(yè)。七、熒光(yíngguāng)補(bǔ)償流式細(xì)胞分析中常需要(xūyào)兩種或兩種以上不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行多色分析。由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射光譜性質(zhì)，發(fā)射光譜范圍有一定的重疊，出現(xiàn)結(jié)果誤差，克服這種誤差的有效方法就是使用熒光補(bǔ)償。第三十頁(yè)，共77頁(yè)。第三十一頁(yè)，共77頁(yè)。第三十二頁(yè)，共77頁(yè)。八、數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)的目的是對(duì)我們感興趣的細(xì)胞進(jìn)行分析，其中設(shè)門技術(shù)是流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析中最為獨(dú)特的技術(shù)，是指在細(xì)胞分布圖中指定一個(gè)范圍或一片(yīpiàn)區(qū)域（門），對(duì)其中的細(xì)胞進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。設(shè)門包括線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意門和四象門等。任意(rènyì)門、矩形門線性門四象門第三十三頁(yè)，共77頁(yè)。多重邏輯門：當(dāng)一種細(xì)胞有兩種以上的參數(shù)需要被分析時(shí)，常需要設(shè)多個(gè)門，各門之間由此出現(xiàn)邏輯關(guān)系(guānxì)，此種設(shè)門技術(shù)稱為多重邏輯門或聯(lián)合門。淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞（CD3+）CD3+CD8-IFN-rIL-4（CD4+）第三十四頁(yè)，共77頁(yè)。數(shù)據(jù)顯示(xiǎnshì)采用的圖:散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為單參數(shù)直方圖和雙參數(shù)散點(diǎn)圖。第三十五頁(yè)，共77頁(yè)。參數(shù)的意義:FSC的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，也就是說，細(xì)胞越大，散射光越強(qiáng)，細(xì)胞越小,散射光越弱;SSC對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可反映細(xì)胞顆粒性程度大小。單參數(shù)直方圖X軸代表熒光(yíngguāng)或散射光的強(qiáng)度，Y軸代該道所具有相同光信號(hào)細(xì)胞的頻率或相對(duì)的細(xì)胞數(shù)；雙參數(shù)散點(diǎn)圖X軸和Y軸均代表散射光或熒光(yíngguāng)的強(qiáng)度.SSCFSC第三十六頁(yè)，共77頁(yè)。

九、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用(yìngyòng)及標(biāo)記方法

第三十七頁(yè)，共77頁(yè)。1、DNA含量分析意義：腫瘤的早期診斷，腫瘤的良惡性(èxìng)判斷，觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)及細(xì)胞周期分布。正常生物細(xì)胞，DNA含量隨著細(xì)胞增殖周期時(shí)相而發(fā)生變化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C）G2/M期（4C）。2C2C→4C4C第三十八頁(yè)，共77頁(yè)。FCM進(jìn)行細(xì)胞周期DNA含量分析時(shí)，需要對(duì)DNA進(jìn)行染色(rǎnsè)，DNA染料（PI）與DNA結(jié)合具有特異性，有一定量效關(guān)系，即DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度與DNA吸收熒光分子多少成正比。FCM分析一個(gè)細(xì)胞群周期與DNA倍體時(shí)，將DNA含量直方圖分為三部分，即G0/G1、S、G2/M三個(gè)細(xì)胞峰。G2/M(4C)G0/G1(2C)

S(2C→4C)G2/M(4C)第三十九頁(yè)，共77頁(yè)。方法：細(xì)胞懸液（1*106）70%冰乙醇4oC，24h離心去固定(gùdìng)液PBS洗2次RNase30minPBS洗1次PI避光,30min上機(jī)采集10000細(xì)胞，MultiCycle軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析G0/G1(2C)

S(2C→4C)G2/M(4C)第四十頁(yè)，共77頁(yè)。當(dāng)人體癌變或者具有惡性潛能的癌前病變時(shí)，在其發(fā)生、發(fā)展過程中可伴隨有細(xì)胞DNA倍體及S期的改變(gǎibiàn)（異倍體）惡性腫瘤細(xì)胞增殖周期的判斷：S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5第四十一頁(yè)，共77頁(yè)。白細(xì)胞分化抗原（CD分子）的命名：1982年世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)，將所有抗體根據(jù)白細(xì)胞分化抗原反應(yīng)性的類型劃分為25群，把每一群抗體稱為一個(gè)分化抗體群(ClusterofDifferentiation，CD)，進(jìn)行編號(hào)、命名，即為單克隆抗體的國(guó)際命名法。由CD抗體群識(shí)別的分化抗原就稱為CD分子。目前(mùqián)已有339個(gè)分化抗體群被鑒定并命名2、淋巴細(xì)胞亞群分析(fēnxī)第四十二頁(yè)，共77頁(yè)。流式細(xì)胞(xìbāo)結(jié)合單克隆抗體技術(shù)能準(zhǔn)確分類計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞(xìbāo)亞群，被認(rèn)為是血液中淋巴細(xì)胞(xìbāo)免疫表型分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。血液淋巴細(xì)胞(xìbāo)是一群特異性極強(qiáng)的細(xì)胞(xìbāo)，根據(jù)淋巴細(xì)胞(xìbāo)的功能及膜表面標(biāo)志，主要分為T淋巴細(xì)胞(xìbāo)(CD3+)、B淋巴細(xì)胞(xìbāo)(CD19+)、NK細(xì)胞(xìbāo)(CD16+56+/CD3-)三個(gè)亞群。第四十三頁(yè)，共77頁(yè)。CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞(xìbāo)（CD3+）淋巴細(xì)胞(xìbāo)B淋巴細(xì)胞(xìbāo)（CD19+）NK細(xì)胞(xìbāo)（CD16+56）+第四十四頁(yè)，共77頁(yè)。NK細(xì)胞(xìbāo):CD(16+56)+/CD3-B淋巴細(xì)胞:CD19+/CD3-NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-第四十五頁(yè)，共77頁(yè)。50ul+10ul相應(yīng)抗體避光孵育15min加OptiLyesC溶血(rónɡxuè)素250ul室溫10minPBS洗一次上機(jī)分析抗體:CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三標(biāo)抗體CD19-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體CD16+56-PE/CD3-FITC二標(biāo)抗體IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型對(duì)照外周血淋巴細(xì)胞亞群標(biāo)記(biāojì)方法（表面標(biāo)記(biāojì)）第四十六頁(yè)，共77頁(yè)。淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)臨床意義：CD3+、CD4+、CD8+總數(shù)降低：細(xì)胞免疫功能低下CD4+（CD4+/CD8+）降低或CD8+(CD8+/CD4+)升高：AIDS、病毒感染、惡性腫瘤（復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)）、再生障礙性貧血等CD4+(CD4+/CD8+)升高或CD8+(CD8+/CD4+)降低：自身免疫性疾、多發(fā)性硬化病、自身免疫性溶血性貧血CD3+CD4+CD8+T細(xì)胞減少：見于免疫球蛋白缺乏癥、胸腺發(fā)育不良、嚴(yán)重免疫缺陷病。第四十七頁(yè)，共77頁(yè)。NK[CD(16+56)+]活性低下：腫瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等NK+[CD(16+56)+]活性增高：多發(fā)性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（B病毒、皰疹病毒、肺TB）、習(xí)慣性流產(chǎn)(liúchǎn)等CD19+B細(xì)胞減少：體液免疫抑制CD19+B細(xì)胞增高：B細(xì)胞惡性增殖性疾病（白血?。┑谒氖隧?yè)，共77頁(yè)。FCM作為白血病輔助(fǔzhù)診斷，免疫分型是急白血病診斷的關(guān)鍵技術(shù)。利用不同類型的白血病具有不同抗原表達(dá)的特異性進(jìn)行分型：髓系、B淋巴系、T淋巴系、非系列特異性等。標(biāo)記方法：往往需要胞漿和胞膜同時(shí)標(biāo)記，一線抗體包括：胞漿（髓系-MPO，B淋巴系-CD79a,T淋巴系-cyCD3）,胞膜(髓系-CD13、CD117，B淋巴系-CD19、CD10,T淋巴系-CD3、CD2)等3、白血病免疫(miǎnyì)分型第四十九頁(yè)，共77頁(yè)。采用CD45和側(cè)向散射(sǎnshè)(SSC）設(shè)門技術(shù)可將各細(xì)胞群分開，熒光從強(qiáng)大到弱：淋巴細(xì)胞群>單核細(xì)胞>成熟粒細(xì)胞>原/幼細(xì)胞(白血病細(xì)胞)，而成熟的紅細(xì)胞和血小板不表達(dá)。第五十頁(yè)，共77頁(yè)。正常(zhèngcháng)骨髓流式細(xì)胞分布圖第五十一頁(yè)，共77頁(yè)。各系表達(dá)的抗原(kàngyuán)造血干細(xì)胞：CD34、CD33髓系表達(dá)：CD13、CD14、CD33巨核細(xì)胞：CD61、CD41B細(xì)胞系：CD10、CD19、CD20T細(xì)胞系：CD2、CD3、CD5、CD7NK細(xì)胞:CD16、CD56、CD57第五十二頁(yè)，共77頁(yè)。細(xì)胞因子（CK）主要由免疫(miǎnyì)細(xì)胞產(chǎn)生，也可由非免疫(miǎnyì)細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生。一種細(xì)胞可產(chǎn)生多種CK，一種CK也可由多種細(xì)胞產(chǎn)生。細(xì)胞因子分為4類：白細(xì)胞介素（lL）；干擾素（IFN）；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子（TNF）。4、細(xì)胞因子的檢測(cè)(jiǎncè)第五十三頁(yè)，共77頁(yè)。血液中未活化的白細(xì)胞內(nèi)無或僅極小量細(xì)胞因子，當(dāng)其被各種激活劑活化后，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子合成增加并不斷分泌到細(xì)胞外而發(fā)揮作用。因此，要測(cè)定(cèdìng)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子較為困難。通常應(yīng)用刺激劑（如：佛波脂）來刺激細(xì)胞因子分泌，同時(shí)加入一定濃度的細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑（如：莫能霉素），使細(xì)胞因子合成后累積在細(xì)胞內(nèi)，通過細(xì)胞因子特異的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光染色，并結(jié)合膜表面抗原染色，進(jìn)行多色分析各種細(xì)胞內(nèi)合成的細(xì)胞因子。第五十四頁(yè)，共77頁(yè)。第五十五頁(yè)，共77頁(yè)。全血或單細(xì)胞(xìbāo)+刺激素(佛波脂)和阻斷劑(莫能霉素)37℃培養(yǎng)4-6h加入細(xì)胞(xìbāo)表面抗體(如CD3、CD4/CD8)孵育20-30minPBS洗1次加固定破膜劑室溫15min加入IFN-r和IL-4抗體孵育30minPBS洗兩次FCM。細(xì)胞因子檢測(cè)(jiǎncè)（IFN-r，IL-4）：第五十六頁(yè)，共77頁(yè)。結(jié)果分析：運(yùn)用流式設(shè)門技術(shù)，先利用前向散射（FS）和側(cè)向(cèxiànɡ)散射（SS）圈出淋巴細(xì)胞，再用CD3+和SSC設(shè)門圈出T淋巴細(xì)胞，再用CD8-/CD3+設(shè)門選定T淋巴細(xì)胞亞群，再分析IL-4+和CD4+/IFN-r淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4第五十七頁(yè)，共77頁(yè)。檢測(cè)Fluo-3/Am是高特異性Ca2+熒光(yíngguāng)指示劑，能與Ca2+特異結(jié)合。Fluo-3它本身是親水性，不易透過膜的，依賴其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨過質(zhì)膜進(jìn)入胞漿，在胞內(nèi)酯酶的作用下，脫去AM重新生成親水性形式，一方面不能再進(jìn)入細(xì)胞器，另一方面易于在胞內(nèi)擴(kuò)散，與游離鈣離子結(jié)合，通過檢測(cè)其熒光(yíngguāng)強(qiáng)度可反映出細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化。單細(xì)胞懸液+flour-3/AM37oC避光孵育40minPBS洗1次上機(jī)檢測(cè)5、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

Ca2+超載是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，導(dǎo)致DNA降解(jiànɡjiě)，促使細(xì)胞凋亡。第五十八頁(yè)，共77頁(yè)。6、線粒體膜電位線粒體膜電位（MMP）是線粒體功能的重要參數(shù)，是評(píng)價(jià)線粒體功能的敏感指標(biāo)，它的大小直接反映線粒體功能及數(shù)量，MMP下降，其氧化(yǎnghuà)磷酸化功能障礙，使ATP產(chǎn)生減少，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。第五十九頁(yè)，共77頁(yè)。Rhodamine123（羅丹明123）、DiOC6、JC-1等多種親脂性的陽(yáng)離子熒光素都能被流式細(xì)胞分析用于作為(zuòwéi)檢測(cè)MMP的探針。這些親脂性熒光染料，對(duì)膜具有通透性，另外線粒體內(nèi)外膜之間存在著跨膜電位，線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)帶負(fù)電荷，當(dāng)它們與活細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，這些陽(yáng)離子熒光素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就能特異地聚集于線粒體，其攝入量與線粒體膜電位成正比。MMP檢測(cè)(jiǎncè)原理及方法：第六十頁(yè)，共77頁(yè)。當(dāng)MMP降低后，線粒體內(nèi)的熒光素會(huì)發(fā)生(fāshēng)外漏，在細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低。檢測(cè)其熒光強(qiáng)度能反映線粒體數(shù)量和MMP的降低或喪失。操作：?jiǎn)渭?xì)胞懸液（1*106）+1umol/L的Rh12337oC,30minPBS洗兩次上機(jī)檢測(cè)第六十一頁(yè)，共77頁(yè)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序結(jié)束其生命的過程。細(xì)胞凋亡為一種可調(diào)控的、主動(dòng)的細(xì)胞死亡過程，有很多的促進(jìn)或抑制凋亡的調(diào)控途徑(tújìng)存在，因而就可以人為地誘導(dǎo)或抑制某些細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到防病、治病的目的。7、FCM檢測(cè)(jiǎncè)細(xì)胞凋亡第六十二頁(yè)，共77頁(yè)。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以無活性的酶原形式存在細(xì)胞內(nèi)，需被水解(shuǐjiě)加工后才能成為有活性的片段。活化的Caspase進(jìn)一步激活其他的Caspase前體，形成了級(jí)聯(lián)放大切割過程，是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，目前已發(fā)現(xiàn)15個(gè)Caspase家族成員，分別命名為Caspase1-15。在Caspase家族成員中，Caspase-3是最重要的指示蛋白酶。（1）Caspase家族(jiāzú)第六十三頁(yè)，共77頁(yè)。操作：?jiǎn)渭?xì)胞懸液（1*106）固定和破膜劑冰浴20minPerm/WashBuffer洗兩次20ul單抗室溫孵育(fūyù)30minPerm/WashBuffer洗1次加0.5mlPerm/WashBuffer上機(jī)檢測(cè)。第六十四頁(yè)，共77頁(yè)。細(xì)胞凋亡過程中有多種基因蛋白參與調(diào)控。凋亡相關(guān)基因可分兩類：誘導(dǎo)凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、ced基因家族等?？沟蛲龌?bcl-2、bcl-XL、Bad等促凋亡基因:bax、bak、bcl-XS等染色(rǎnsè)標(biāo)記同Caspase（2）凋亡相關(guān)(xiāngguān)基因蛋白第六十五頁(yè)，共77頁(yè)。Fa