基因工程課件2-實(shí)驗(yàn)1：質(zhì)粒DNA的小量制備

基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的小量制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊螅?、掌握用堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA2、了解制備原理及各種試劑的作用一、背景知識（載體及質(zhì)粒）二、實(shí)驗(yàn)原理（堿裂解法）三、實(shí)驗(yàn)材料四、實(shí)驗(yàn)步驟五、預(yù)期結(jié)果六、注意事項(xiàng)一、背景知識——載體及質(zhì)粒1、載體功能：為目的基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。為目的基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制能力或整合能力。為目的基因提供在受體細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)能力。2、載體種類質(zhì)粒、噬菌體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體……3、理想載體的基本條件可轉(zhuǎn)移性合適的復(fù)制位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)：廣泛、特異選擇標(biāo)志，便于篩選和鑒定分子較小，可容納較大的外源DNA4、質(zhì)粒（1）特點(diǎn)：存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。具有自我復(fù)制功能。帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標(biāo)記物。經(jīng)改造后具有多克隆位點(diǎn)。舉例：pMD-18T質(zhì)粒宿主細(xì)胞

ori抗Amp宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基多種酶切口多克隆位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶單一酶切口多克隆位點(diǎn)ori復(fù)制起始點(diǎn)遺傳標(biāo)記Amppolylinker基因載體PMD-18T質(zhì)粒的物理圖譜二、堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA原理堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。

堿裂解法提取質(zhì)粒主要包括三個(gè)部分：（1）裂解細(xì)胞加入堿性SDS，破壁與膜，處理的同時(shí)也能去除細(xì)胞碎片、染色體DNA等雜質(zhì)。堿性SDS法相對較劇烈，只能抽提小于10kb的質(zhì)粒。（2）分離當(dāng)溶液的pH值調(diào)節(jié)到大于12時(shí)，雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA雙鏈分離成單鏈；而超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒DNA僅僅部分氫鍵被破壞，只是部分雙鏈解離成單鏈。再將溶液的pH值調(diào)回中性時(shí)，單鏈DNA互相纏繞并且與蛋白質(zhì)結(jié)合生成網(wǎng)絡(luò)狀大分子，而超螺旋的質(zhì)粒發(fā)生復(fù)性反應(yīng)后仍然是小分子，通過離心很容易將兩者分開。達(dá)到分離的目的。（3）純化細(xì)胞裂解液中的雜質(zhì)除了染色體DNA外，還有各種細(xì)胞壁、膜的碎片、各種酶與其他蛋白質(zhì)、脂質(zhì)類雜質(zhì)以及RNA等。離心去除各種細(xì)胞碎片；用酚處理去除蛋白質(zhì)，包括各種酶；用RNA酶處理去除RNA等。氯仿有強(qiáng)烈的溶脂性，可去除脂質(zhì)類雜質(zhì)。氯仿能將微量的溶于DNA水溶液中的酚抽提掉。異戊醇減少泡沫，使分層明顯無水乙醇沉淀法去除水溶液中的痕量酚、氯仿等。沉淀DNA時(shí)加入鹽類的目的是中和鏈上的電荷，使DNA易于形成沉淀。70%乙醇進(jìn)行洗滌DNA沉淀，去除鹽類等溶于水的物質(zhì)。溶液I、II和III的作用：溶液I：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl組成。葡萄糖——增加溶液的粘度，減少抽提過程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞質(zhì)粒DNA；EDTA——絡(luò)合掉Mg2+等二價(jià)金屬離子，防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用；Tris?Cl——能使溶菌液維持溶菌作用的最適pH范圍。溶液II：由SDS與NaOH組成。SDS——破細(xì)胞膜及壁，解聚核蛋白，并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性；NaOH(pH>12)——破壞氫鍵，使DNA分子變性，同時(shí)強(qiáng)堿也使蛋白質(zhì)變性，減輕核酸酶對質(zhì)粒DNA的降解作用的可能性。溶液III：由KAc與HAc組成，是pH值為4.8~5.5的高鹽溶液。中和溶液II的堿性，使染色體DNA復(fù)性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。K+離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì)，很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離，此外，高鹽溶液也有利于各種沉淀的形成。三、實(shí)驗(yàn)材料1、儀器和材料大腸桿菌(E.coli)單菌落或凍存菌種。恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、臺式高速離心機(jī)、臺式小型振蕩器、Ep（Eppendorf）管（1.5mL微量離心管）、取液器（20μL~lmL）、吸頭。2、試劑

(1)DNA提取溶液（溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，見附錄）

(2)TE緩沖液（pH8.0）

(3)酚:氯仿液(酚:氯仿=1:1)(4)無水乙醇，70％乙醇

(5)LB培養(yǎng)液

(6)氨芐青霉素（終濃度為50~100μg/mL）

(7)RNA酶（10mg/mL貯藏液）四、實(shí)驗(yàn)步驟轉(zhuǎn)移上清至另一新Ep管

4℃，12000r/min，10min

加150μL冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，倒轉(zhuǎn)，輕輕震蕩，使充分接觸，置冰上3~5min

加200μL新配置的溶液Ⅱ，倒轉(zhuǎn)混勻，勿震蕩加入100μL的溶液I，充分重懸細(xì)菌沉淀上清液中加等體積酚:氯仿溶液，振蕩混勻

4℃，

12000r/min離心5min，小心吸去上清，得到DNA沉淀加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，振蕩混勻，室溫放置2min

小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至另一新Ep管中（注意分界處的白色蛋白薄層）

4℃，12000r/min，5min

（二）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA

用槍輕輕吹吸沉淀，使充分重懸400μL700μL（三）純化質(zhì)粒DNA加lmL預(yù)冷的70％乙醇，洗滌沉淀4℃，12000r/min，5min，小心去上清，留沉淀，室溫蒸發(fā)痕量乙醇10~30min

用20μL含有胰RNA酶（20μg/mL）的TE(或無菌雙蒸水)，重新溶解DNA，貯存于-20℃?zhèn)溆梦?、預(yù)期結(jié)果若所取菌液量大，一般經(jīng)乙醇沉淀離心后，肉眼會(huì)看到Ep管壁一側(cè)有灰白色沉淀物，其定性及定量需進(jìn)行電泳檢測。六、注意事項(xiàng)l、提