河北師大微生物實驗五課件

實驗五從土壤中分離純化放線菌一、實驗目的1.

掌握配制培養(yǎng)基的原則和方法。2.

掌握微生物分離和純化的原理和方法。二、實驗原理1.微生物的分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程。方法主要有：簡易單細胞挑取法和平板分離法。2.土壤是微生物生活的大本營，是發(fā)掘微生物資源的重要基地！放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中（主要是鏈霉菌），其數(shù)量僅次于細菌。3.放線菌是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的革蘭氏陽性細菌。4.涂布平板法：將含有各種微生物的土壤懸液稀釋不同倍數(shù)后，涂布接種到平板培養(yǎng)基上，在適宜條件下培養(yǎng)，從中選取放線菌，接種到斜面培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。三、實驗材料1.培養(yǎng)基：高氏I號培養(yǎng)基。2.樣品：花園2cm深土壤。3.儀器及其他用品：酒精燈、載玻片、蓋玻片、顯微鏡、滴管、試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶、槍頭、涂布器等。四、實驗步驟1.高氏I號培養(yǎng)基的配制及分裝2.物品準備3.滅菌4.鋪試管斜面，倒平板5.分離6.放線菌純化7.形態(tài)觀察1.高氏I號培養(yǎng)基的配制及分裝(五組)

高氏一號合成培養(yǎng)基是培養(yǎng)放線菌的培養(yǎng)基。（1）配方：

可溶性淀粉40g，NaCl1g，KNO31g，K2HPO41g，MgSO41g，F(xiàn)eSO42mL，瓊脂40g，H2O2000mL，pH

7.2～7.4（2）在鍋內(nèi)加入一定體積水后加入可溶性淀粉，加熱溶解后，加入無機鹽，待水沸騰后，減小火力，加入瓊脂粉，溶融后，定容至所需體積。調(diào)pH值。（注意：加入瓊脂粉后，注意攪拌，勿煮糊。）配1.7L培養(yǎng)基。分裝：將上述所制溶液分裝入500mL錐形瓶中，250mL/瓶，共5瓶；共1250mL。10mL左右/試管，共42管，共420mL，7個試管一捆（6捆）。1.高氏I號培養(yǎng)基的配制及分裝(五組)2.物品準備（分組進行）盛有9mL水的試管，6支（試管用棉塞塞?。┰谌莘e為250mL的三角瓶內(nèi)加入玻璃珠，以蓋住瓶底為宜（作用：打散土壤結塊），再加入90mL蒸餾水，1瓶試管斜面8支（每組準備好試管和棉塞，第五組準備培養(yǎng)基）平板9個（5個/包，共9包）1mL槍頭盒，1盒涂布器8支3.滅菌

將上述培養(yǎng)基和準備的物品于121oC，20~30min高壓蒸汽滅菌。4.鋪試管斜面，倒平板1.將42根裝有培養(yǎng)基的試管斜放，制成斜面培養(yǎng)基。2.倒平板，每個梯度要有一個平行，要有空白對照。5.分離注意：以下各分離步驟均在無菌條件下進行（無菌操作）。（1）稱取土壤樣品10g，倒入含有90mL水和玻璃珠的三角瓶中振蕩5min，使土樣充分打散。（注意：等水冷卻了再倒入土樣。）（2）無菌條件下，將土壤懸液稀釋成10-2~10-7系列濃度。具體稀釋過程：用無菌吸管無菌操作取10-1濃度的土壤懸液1mL并加入編號10-2的無菌試管中，震蕩混合均勻。即為10-2濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-7的試管中（每個稀釋度換1支槍頭）。（3）分別用移液器精確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液0.2~0.3mL，對號放入編好號的無菌培養(yǎng)皿中，每一濃度對應兩個平板。用無菌涂布棒（從濃度小的梯度開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個平板表面涂勻，涂完一個平板用酒精燈滅菌。（4）將上述所涂平板置于28～30℃溫度下，倒置培養(yǎng)一周。6.放線菌純化(1)肉眼觀察確認放線菌的菌落。怎么確認？(2)在無菌條件下，挑取單菌落的孢子“之”字劃線于試管的斜面上。(3)將試管置于28～30oC的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周。7.形態(tài)觀察（1）直接觀察（同霉菌）：在培養(yǎng)基中，整體觀察放線菌的菌落特征及其顏色。（2）印片觀察：取一小塊帶培養(yǎng)基的菌落正放于載玻片上，然后用另一載玻片加熱后按壓，注意不要滑動玻片。取上面的印片，有印跡的一面朝上，在40x物鏡下觀察。如需染色，先將有印跡的載玻片通過火焰2～3次固定，再用美藍染色觀察（染色1min，水洗，干燥后觀察）。干燥、不透明、表面呈致密的絲絨狀，上有一薄層彩色的“干粉”菌落和培養(yǎng)基的連接緊密，難以挑取菌落正反面顏色常不一致，菌落邊緣的瓊脂平面有變形的現(xiàn)象……放線菌上圖：A：諾爾斯氏鏈霉菌；B：皮疽諾卡氏菌；C：酒紅脂孢囊菌；D：游動放線菌；E：小單胞菌；F：皺雙孢馬杜拉放線菌下圖：A：卡特利鏈霉菌；B：弗氏鏈霉菌；C：吸水鏈霉菌金淚亞種；D：卡那霉素鏈霉菌；E：除蟲鏈霉菌；F：生磺酸鏈霉菌玫瑰花鏈霉菌螺旋形孢子鏈