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流動(dòng)相的調(diào)節(jié)是搞液相分析最重要的環(huán)節(jié),也是液相水平高低的度量,每一種液相都有影響它的主要因素,抓住主要因素,問(wèn)題就容易解決。歡迎大家討論。一則可以為新手傳播知識(shí),二則大家相互學(xué)習(xí)共同提高!先開個(gè)頭:常用的是化學(xué)鍵合相色譜,分離中性化合較簡(jiǎn)單,主要是調(diào)節(jié)溶劑強(qiáng)度,可從有機(jī)相的比例合種類兩個(gè)方面入手,例如:有機(jī)相占的比例大,出峰就早。分離酸堿化合物就就復(fù)雜一點(diǎn),增加了添加劑,明白了添加劑的作用,然后從溶劑,酸堿性,添加劑等方面入手。問(wèn)題就容易解決。液相色譜采用鍵合硅膠可以分離絕大多數(shù)的分析物質(zhì),針對(duì)不同化學(xué)性質(zhì)的單體采用不同的鍵合硅膠,現(xiàn)在有什么十八烷、氨基柱、氰基、苯基太多了,再加上不同流動(dòng)相也就是加入不同的抑制劑可以測(cè)許多成分,比如:酸性的可以用十八烷加入酸,加緩沖鹽;堿性物質(zhì)可以加緩沖鹽,以個(gè)人來(lái)講用離子對(duì)的形式較多,并且效果也很好,現(xiàn)在分析生物堿是比較難做的,我現(xiàn)在就有一個(gè)難題,就說(shuō)鹽酸水蘇堿吧,在低波長(zhǎng)的吸收,UV是不行了,用蒸發(fā)光檢測(cè)器,但是分離又成了問(wèn)題,我試了十八烷,氨基柱、氰基、都不理想,并且用過(guò)日本的shodex(C18)柱PH9-10不好。不好做呀,在郁悶中 如用反相色譜柱時(shí),一般先改變有機(jī)相與水相的比例;再考慮改變pH值,酸性物質(zhì)將pH值調(diào)低,堿性物質(zhì)將pH值調(diào)高;如兩者都無(wú)效,可考慮加入離子對(duì)試劑,如庚烷磺酸鈉用于(堿性藥物)我覺(jué)得溶劑過(guò)濾器抽濾時(shí)抽走一部分有機(jī)相使保留時(shí)間相差較大。其實(shí)流動(dòng)相的調(diào)節(jié)也是很難的,一個(gè)條件下來(lái)是非常的不易呀,從查文獻(xiàn)到,條件成熟,有一次我做麻黃就是二個(gè)月呀,最后才定下來(lái),現(xiàn)在的水蘇堿又是一個(gè)大頭,現(xiàn)在為什么生物堿這樣的難做呢,柱前衍生我是考慮過(guò),但對(duì)柱子是有影響的,同時(shí)處理也麻煩。對(duì)于流動(dòng)相的抽濾對(duì)測(cè)定是沒(méi)什么影響的,一個(gè)穩(wěn)定的條件,是不計(jì)較那一點(diǎn)損失的,如果抽濾對(duì)于測(cè)定的影響非常之大這個(gè)條件是不穩(wěn)的?,F(xiàn)在的流動(dòng)相在檢驗(yàn)所比例是可調(diào)的,但酸堿不變,所以我個(gè)人認(rèn)為在一定的比例范圍內(nèi),耐用性一定要好。有高手的話對(duì)我的水蘇堿給一點(diǎn)意見反相HPLC中的溶劑優(yōu)化:1?首先應(yīng)調(diào)整k'值:強(qiáng)溶劑一20%遞減一選擇合適的溶液強(qiáng)度,使得k'在1?20(tR:3?35min)。一種方法是首先試用一種可能過(guò)強(qiáng)的流動(dòng)相,在后面的試驗(yàn)中逐漸減小溶劑強(qiáng)度以增大k。當(dāng)所有譜峰符合1vk'<20的范圍時(shí),從溶劑強(qiáng)度的觀點(diǎn)來(lái)說(shuō),其流動(dòng)相已接近最佳了。(觀察待分離組分的分離度)。(反相色譜一一溶劑極性弱洗脫能力強(qiáng),組分k'減?。?。另一種方法是首次用梯度洗脫試驗(yàn)。通過(guò)這一實(shí)驗(yàn),有可能估計(jì)出使樣品的k'值符合1<k'<20范圍的大概溶劑成分。2?改變選擇性(占):根據(jù)分子間作用力將溶劑分組。不同組的溶劑選擇性不同,根據(jù)溶劑分組改變?nèi)軇┓N類即可改變選擇性。離子對(duì)HPLC中的溶劑優(yōu)化:離子對(duì)色譜法是分離離子,或可電離的分子的一種色譜技術(shù)。關(guān)于離子對(duì)色譜的機(jī)理,至今仍不十分明確,但己提出三種機(jī)理:離子對(duì)形成機(jī)理,離子交換機(jī)理,離子相互作用機(jī)理。在以下討論中,采用離子對(duì)形
成機(jī)理?;驹恚河幸簧V體系,固定相為非極性,如C18型鍵合相,流動(dòng)相為水溶液,并在其中加入一種電荷與組分離子相反的離子B+,B+離子由于靜電引力,與帶負(fù)電的組分離子生成離子對(duì),故稱它為平衡離子或成對(duì)離子。由于離子對(duì)具有疏水性,因而被非極性固定相(即有機(jī)相)提取。組分離子的性質(zhì)不同,它與平衡離子形成離子對(duì)的能力大小不同,以及離子對(duì)的極性不同,導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留的時(shí)間不同,因而各離子先后離開色譜柱,這就是離子對(duì)色譜法的基本原理。以上這類色譜法稱反相離子對(duì)色譜法。能用離子對(duì)色譜法分離的樣品種類很多。它可以用于極性樣品,如堿類、酸類、離子、以及帶有可離解的多種官能團(tuán)化合物的分離??捎糜谏眢w液的分析,如甾族化合物以及體液中藥物的分析。反相離子對(duì)色譜中流動(dòng)相的影響小結(jié):1?改變選擇性:a?改變?nèi)軇┓N類:改變?nèi)軇┻x擇性的方法,類似于鍵合相色譜所介紹的原則。選用不同選擇性組別的溶劑,可使流動(dòng)相的選擇性得到明顯改進(jìn)。b?改變pH:組分離子與平衡離子的生成,離子對(duì)的形成,都與流動(dòng)相的pH值密切相關(guān)。改變流動(dòng)相的pH可以改變體系的選擇性。流動(dòng)相的pH值應(yīng)調(diào)節(jié)到能使不同組分有合適的離解度,而使提供平衡離子的化合物能完全離解。要符合這一要求,只有使提供平衡離子的化合物在一個(gè)很寬的pH范圍內(nèi)保持完全離解,因此,只有強(qiáng)酸鹽(高氯酸鹽或烷基磺酸鹽)和強(qiáng)堿鹽(季銨鹽)才滿足此要求。c■系統(tǒng)選擇:使用一種有機(jī)溶劑(甲醇);流動(dòng)相的其它三種成分為pH=(□和卩日=匚的緩沖液以及另一種pH=、其中含有最大濃度(例如:200mM)的離子對(duì)試劑的緩沖液(D)。以組合不一的緩沖液(B—D)進(jìn)行七次實(shí)驗(yàn),并變化甲醇(A)量以保持每次實(shí)驗(yàn)的k'值范圍大致恒定。三?正相HPLC中的溶劑優(yōu)化溶劑非極性溶劑:正己烷或FC-113(1,1,2-三氟-1,1,2-三氯乙烷)極性溶劑:非定位、堿性定位和非堿性定位按正相HPLC中譜峰間距效應(yīng)分類的溶劑取代和定位是正相HPLC流動(dòng)相選擇性的主要來(lái)源溶劑強(qiáng)度調(diào)節(jié)選擇性影響四、梯度洗脫梯度洗脫給色譜分離帶來(lái)很大的方使,已成為高效液相色譜法不可缺少的部分。所謂梯度洗脫,就是有兩種(或兩種以上)不同極性的溶劑,在分離過(guò)程中按一定程序連續(xù)地改變,以改變流動(dòng)相的配比和極性。通常用的流動(dòng)相為二元的。梯度期間,強(qiáng)溶劑B(如反相HPLC中的甲醇)的濃度增大。在下述討論中,我們將這種溶劑的濃度寫作B%。梯度洗脫對(duì)分離一定種類的樣品很理想??商岣叻蛛x度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測(cè)量和提高分離精度。梯度洗脫對(duì)于復(fù)雜混合物、特別是保留值相差較大的混合物的分離是極為重要的手段。因?yàn)檫@些樣品的k'范圍寬,不能用等度方法簡(jiǎn)單地處置。梯度洗脫期間的平均k'值tR=tm(1+k')VR=Vm(1+k')=Vm+kVs
我做液相時(shí),為什么主峰總是出現(xiàn)肩峰?是柱效降低了還是制劑中的成分沒(méi)有完全被分離出來(lái)?應(yīng)該如何處理肩峰?出現(xiàn)上述情況的原因,可能大致考慮以下幾個(gè)方面:一、就是組分影響,也就是有與主峰保留時(shí)間相近的組分峰(雜質(zhì)峰)的存在;二、柱子柱效明顯降低,是柱子要壞掉的先兆;三、主藥在流動(dòng)相中發(fā)生部分離解,使一部分主藥的結(jié)構(gòu)狀態(tài)發(fā)生改變。等。解決方法,對(duì)應(yīng)解之,即可。(個(gè)人見解)各們講的都很厲害啊,我是初學(xué)者不太了解。但在操作中常要根據(jù)要分離的物質(zhì)加適當(dāng)?shù)碾x子對(duì)試劑,而離子對(duì)試劑是如何選擇的呢?我在做鹽酸水蘇堿時(shí)也遇到了樓上的問(wèn)題,嘗試了UV及ELSD,都不是很理想,最近看到有人用柱前衍生然后用UV,但自己沒(méi)做過(guò),不知效果怎樣。但出于檢測(cè)方法應(yīng)該越簡(jiǎn)單越好真想快點(diǎn)找個(gè)即簡(jiǎn)便又有效的方法。我也在做鹽酸水蘇堿,用的是SCX(離子交換柱)柱,出峰時(shí)間在8――9分鐘之間,樣品經(jīng)處理后基線分離的比較好,唯一不好的就是峰型有些拖尾。因?yàn)樗牧鲃?dòng)項(xiàng)是緩沖溶液,所以調(diào)了一下配比,發(fā)現(xiàn)離子交換柱出峰并不象ODS柱那么有規(guī)律,隨著pH的加大,峰對(duì)稱性升高,峰寬減小,離子交換柱出峰有一明顯波谷反而寬度增加,峰形變大。鹽酸水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)品峰對(duì)稱性最多只能達(dá)到不過(guò)還是比ODS柱出峰要好針對(duì)做生物堿的朋友:用常規(guī)的ODS柱會(huì)出現(xiàn)一個(gè)最普遍的問(wèn)題是:峰很寬,拖尾很嚴(yán)重!原因:ODS柱有很多未鍵合的硅羥基,與N締合造成。解決方案:使用BDS柱,他是用堿鈍化殘余的硅羥基,很好的避免了拖尾現(xiàn)象!用常規(guī)的SCX離子交換柱會(huì)出現(xiàn)一個(gè)普遍的問(wèn)題是:重現(xiàn)性差,隨流動(dòng)相的pH值大小,Rt變化大!原因:所謂離子交換柱,就是陰陽(yáng)正負(fù)離子的交換,由于流動(dòng)相的離子濃度的變化,勢(shì)必會(huì)影響交換平衡!解決方案:流動(dòng)相用Buffer緩沖液!向各位老師請(qǐng)教,我做液相時(shí)出現(xiàn)了進(jìn)空白,樣品,原料都沒(méi)有主峰的現(xiàn)象,過(guò)去做過(guò)這個(gè),正常,請(qǐng)幫忙分析一下補(bǔ)充一下,以前配流動(dòng)相是乙腈與鹽混合過(guò)濾,再超聲,這次是先濾鹽,后濾乙腈,再超聲,這一步應(yīng)沒(méi)問(wèn)題吧
我買的新的ODS碳18柱子,做白藜蘆醇和它的苷,標(biāo)樣混標(biāo),出峰比較好.但是后幾個(gè)點(diǎn)保留值提前,今天進(jìn)樣,發(fā)現(xiàn)有肩峰,但是保留時(shí)間基本一致?流動(dòng)相是甲醇和水,40比60.怎么辦呢hu_2104411wrote:我買的新的ODS碳18柱子,做白藜蘆醇和它的苷,標(biāo)樣混標(biāo),出峰比較好.但是后幾個(gè)點(diǎn)保留值提前,今天進(jìn)樣,發(fā)現(xiàn)有肩峰,但是保留時(shí)間基本一致?流動(dòng)相是甲醇和水,40比60.怎么辦呢可能是柱子臟了,用異丙醇或者四氫咲喃沖洗一下,柱子現(xiàn)在的壓力比最初使用時(shí)高多少?請(qǐng)問(wèn)base-deactivatedoctadecylsilylsilicagel是什么柱?謝謝!to:xinyiaabds是填料經(jīng)過(guò)堿基去活的ods,就是將硅膠表面的硅醇基堿性硅烷化,適合于弱堿性和弱酸性化合物.對(duì)于某些色譜的分離較好。對(duì)于離子對(duì)色譜,有時(shí)不加離子對(duì),分離也很好,峰的對(duì)稱性也有很大改善,當(dāng)然,其作用不止這些??梢援?dāng)作普通
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