dnaran瓊脂糖凝膠電泳課件

核酸的提取及瓊脂糖凝膠電泳

目錄核酸組成理化性質(zhì)核酸分離、純化的原則核酸提取的基本步驟材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解分離、純化沉淀溶解DNA提取的常用方法RNA提取的常用方法核酸的保存瓊脂糖凝膠電泳

核酸DNARNAGenomicDNA(原核、真核、病毒)細(xì)胞器DNA(葉綠體、線粒體等)質(zhì)粒DNA(細(xì)菌、放線菌等)mRNA(1%-5%)rRNA(80%-85%)tRNA(小分子RNA)(15%-20%)核酸(nucleicacid)核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。核酸分離、純化原則1、保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性溫度不要太高控制pH值范圍(pH值5-9)

保持一定離子強(qiáng)度減少物理因素對核酸的機(jī)械剪切力核酸分離、純化原則核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑2、防止核酸的生物降解DNA酶抑制劑金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。陰離于型表面活性劑

SDS除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物有核酸酶抑制劑作用。1：手指頭

2：槍頭

3：水/緩沖液

4：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面

5：內(nèi)源Rnase6：RNA樣品

7：質(zhì)粒抽提

8：RNA保存

9：陽離子(Ca,Mg)10：后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶Rnase污染的10大來源DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.裂解III.分離、純化IV.沉淀或吸附核酸V.溶解材料準(zhǔn)備使用新鮮材料，樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；蛋白酶處理核酸分離、純化

多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。核酸沉淀、溶解重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。核酸的保存(1)對DNA

①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②長期保存樣品中可加入1滴氯仿。(2)對RNA

①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;②長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;DNA提取的常用方法基因組DNA的提取SDS法其它原理基因組DNA－SDS法SDS在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝А５望}高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。其他方法硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂磁珠低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。陰離子交換樹脂磁珠低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。陰離子交換樹脂磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。磁珠低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。陰離子交換樹脂磁珠硅質(zhì)材料高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝А９栀|(zhì)材料低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。陰離子交換樹脂高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。陰離子交換樹脂磁珠磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。磁珠Trizol是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍，酚等物質(zhì)，異硫氰酸胍能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。核酸由于核蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞而解離下來。異硫氰酸胍同時(shí)抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，保持RNA的完整性。TRIZOL法提RNA問題一：DNA降解材料不新鮮、反復(fù)凍融或細(xì)胞衰老提取操作過于劇烈，DNA被打斷外源核酸酶污染低溫保存，避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后操作應(yīng)盡量輕柔試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌DNA分裝保存于緩沖液，避免反復(fù)凍融核酸提取常見的問題問題二：DNA樣品不純DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）RNA提取常見問題二：得率低

樣品太多或太少RNA在柱子上未洗出洗出液中有酒精減少或增加樣品使用量加入RNaseFree,放置幾分鐘再離心漂洗后再次離心RNA提取常見問題三：降解

樣品不新鮮或保存不當(dāng)RNase污染RNA溶液儲(chǔ)存不當(dāng)取新鮮的樣品；取樣后立即放入液氮或儲(chǔ)存液保存研磨樣品及時(shí)補(bǔ)充液氮嚴(yán)格處理相應(yīng)的器具和試劑-70℃凍存，分裝使用

為了檢測提取核酸的濃度和內(nèi)參，需要繼續(xù)做瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理（1）DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動(dòng)。分子質(zhì)量越小跑得越快，緊密構(gòu)型快于松散型開環(huán)分子或線性分子，從而可以分離大小不同的DNA或RNA分子。

（2）瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠緩沖液（1）制備凝膠和膠板：

100ml(1×TBE)+1g瓊脂糖（三角瓶），煮膠，溶解，冷卻至60℃(不燙手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室溫下充分凝固，豎直拔下梳子。（2

）加樣：

5μl質(zhì)粒DNA+1μlloadingbuffer，混勻

5μlPCR產(chǎn)物+1μlloadingbuffer，混勻（3）電泳：電壓80-120V，注意電極方向15min（4）觀察：紫外透射分析儀下觀察。電泳常見問題分析DNA降解：避免核酸酶污染。電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液多次用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。

DNA變性：電泳前勿加熱，可以在電泳儀上面放冰袋，避免溫度高變性條帶淺，Marker彌散了---那要么就是膠的問題，要不就是buffer的問題?；z的時(shí)候一定要化勻，buffer盡量用新鮮的

實(shí)驗(yàn)室跑一般都是120V,最多跑到150VDNA電