淺析AngⅡ?qū)Ω鼓らg皮細胞ROS和NADPH氧化酶亞基p47phox表達的影響及黃芪的干預(yù)作用的論文

淺析AngⅡ?qū)Ω鼓らg皮細胞ROS和NADPH氧化酶亞基p47phox表達的影響及黃芪的干預(yù)作用的論文【內(nèi)容摘要】目的探討angⅱ對腹膜間皮細胞ros和nadph氧化酶亞基p47phox表達的影響及二代腹膜間皮細胞經(jīng)黃芪注射液(agi)預(yù)處理后的干預(yù)作用。方法體外培養(yǎng)sd大鼠原代腹膜間皮細胞至2代，靜止24h后，隨機分為：正常對照組(a組)，angⅱ(10-7mol/l)組(b組)，angⅱ+agi(2g/ml)組(c組)，angⅱ+agi(1g/ml)組(d組)。用熒光染料(dcf)及激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)活性氧(ros)。rt-pcr檢測nadph氧化酶亞基p47phox的表達。western印跡檢測p47phox的蛋白表達。結(jié)果①angⅱ可顯著增加大鼠腹膜間皮細胞ros產(chǎn)生，刺激20min后，ros的表達較對照組顯著上升(p0.05)。agi可顯著抑制angⅱ刺激后ros的產(chǎn)生,且agi對ros的抑制程度與agi的濃度呈正相關(guān)，b組、c組、d組三組比較后差異顯著(p0.05);②大鼠腹膜間皮細胞經(jīng)angⅱ刺激后，nadph氧化酶亞基p47phoxmrna和蛋白的表達均上升，agi可抑制angⅱ誘導(dǎo)的p47phoxmrna的表達上調(diào)，c、d兩組分別與b組比較后差異顯著(p0.05)。結(jié)論angⅱ可誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細胞產(chǎn)生的ros增加、nadph氧化酶亞基p47phox表達上調(diào);agi可抑制nadph氧化酶的表達和活性及ros的產(chǎn)生，從而為agi防治腹膜纖維化提供了理論依據(jù)。11665【本文關(guān)鍵詞語】腹膜間皮細胞;血管緊張素ⅱ;活性氧;nadph氧化酶;黃芪abstract:objectivetoexploretheeffectsofangiotensinⅱonthereactiveoxygenspeciesofperitoneummesothelialcellsandexpressionofnicotinamide-adeninedinucleotidephosphate(nadph)oxidasesubunitp47phoxaswellastheroleofastragalusinjection(agi)interventionforsecond-generationperitoneummesothelialcells.methodsprimaryratperitoneummesothelialcellswereculturedintothesecondgenerationinvitro.aftersynchronizationfor24hours,thecellswererandomlyassignedtocontrolgroup(groupa),angⅱ(10-7mol/l)group(groupb),angⅱ+agi(2g/ml)group(groupc),andangⅱ+agi(1g/ml)group(groupd).thedcf-sensitivecellularroswasmeasuredbyfluorometricassayandconfocalmicroscopy.rt-pcrwasemployedtodetectthemrnaexpressionofnadphoxidasesubunitp47phox,andp47phoxproteinexpressionwasexaminedbywesternblot.results①angⅱsignificantlyinducedtheproductionofintracellularroscomparedwithcontrol(p0.05).afterstimulationfor20minutes,rosexpressionincreasedsignificantlycomparedwiththatincontrolgroup(p0.05).agiinhibitedangⅱ-inducedrosgeneration,andtheinhibitoryeffectwaspositivelycorrelatedwithitsconcentration.groupsb,candddifferedsignificantlyfromeachother(p0.05).②angⅱstimulatednadphoxidasesubunitp47phoxmrnaandproteinoverexpressions,andagiinhibitedtheup-regulationofp47phoxmrnaoverexpression.groupscanddwerecomparedwithgroupb,respectively(p0.05).conclusionangⅱcansignificantlyinducetheproductionofratperitoneummesothelialintracellularrosandup-overexpressionofnadphoxidaseandcellularrosgeneration,whichprovidestheoreticalbasisforagispreventionofperitonealfibration.keywores:peritoneummesothelialcell;angiotensinⅱ;reactionoxygenspecies;nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate(nadph)oxidase;astragalus腹膜纖維化是長期腹膜透析(peritoneumdialysis,pd)患者的重要并發(fā)癥之一，最終導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)異常、喪失超濾功能而退出腹膜透析。高糖腹膜透析液可引起腹膜發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)和功能異常。近年研究證實，血管緊張素ⅱ(angiotensinⅱ,angⅱ)參與了腹膜間皮細胞的轉(zhuǎn)分化和細胞外基質(zhì)的積聚，與腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2];煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adeninedinucleotidephosphate,nadph)氧化酶作為活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)的調(diào)控酶，其胞漿亞基p47phox在多種組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著樞紐性作用[3-4]。調(diào)節(jié)nadph氧化酶亞基p47phox的表達及活性成為改善氧化應(yīng)激狀態(tài)、防治腹膜纖維化的重要切入點。色譜指紋圖譜證實黃芪注射液有穩(wěn)定的清除自由基、抗氧化的色譜峰[5]，超微結(jié)構(gòu)證實黃芪注射液能拮抗高糖環(huán)境對腹膜間皮細胞的氧化應(yīng)激損傷[6-7]。為此，本研究應(yīng)用黃芪注射液來觀察angⅱ對腹膜間皮細胞的影響，以探討angⅱ對腹膜間皮細胞ros和nadph氧化酶亞基p47phox等表達的影響、及黃芪的干預(yù)作用，為腹膜纖維化防治提供新的思路。1材料與方法1.1主要試劑胎牛血清(fbs)、dmem/f12干粉培養(yǎng)基(gibco公司);胰蛋白酶(amerasco公司);angiotensinⅱ(sigma,usa);黃芪注射液(正大青春寶藥業(yè)生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字z33020179，每支10ml相當(dāng)于原材料20g);h2-dcfda(molecularprobes,usa);trizol試劑(invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(fermentas公司);taqdna聚合酶(fermentas公司);rnase抑制劑(gibcobrl公司);焦碳酸二乙酯(depc，博彩公司);dnamarker(dl2000，takara公司);瓊脂糖(biolabs公司);兔抗大鼠p47phox抗體(upstate公司，usa);兔抗大鼠gapdh抗體(dako公司，denmark);bca法蛋白濃度測定試劑盒(pierce公司);temed(sigma公司)，其余化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。1.2大鼠腹膜間皮細胞的分離與培養(yǎng)[8]健康清潔級雄性sd大鼠，體重180～220g，由河南科技大學(xué)機能實驗中心提供，每只肌肉注射100ml/l水合氯醛約0.6～1.0ml。待麻醉后向大鼠腹腔內(nèi)注射20～30ml2.5g/l胰蛋白酶+0.2g/ledta消化液。2h后斷頸處死大鼠，750ml/l酒精全身浸泡消毒5min。將大鼠仰面放置于超凈工作臺上，沿腹白線依次剪開腹壁皮膚及肌肉，吸出腹腔內(nèi)液體，移入15ml離心管中。1500r/min離心15min，棄上清，加入含100ml/lfbs的dmem/f12培養(yǎng)液，輕輕用吸管吹打使之成為細胞混懸液，分裝于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中。再加入培養(yǎng)基使之總體積達到4～5ml，放入條件為37℃、950ml/l空氣、50ml/lco2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d更換一次培養(yǎng)基。免疫組織化學(xué)方法鑒定結(jié)果示細胞角蛋白(cytokeratin)陽性，將2代腹膜細胞隨機分為以下4組：正常對照組，angⅱ(10-7mol/l)刺激組，兩組用無血清的dmem/f12培養(yǎng)基培養(yǎng);黃芪注射液高濃度(2g/ml)干預(yù)組，黃芪注射液低濃度(1g/ml)干預(yù)組，兩組提前孵育1h進行干預(yù)處理。在合適的時間點，觀察以上各組各指標(biāo)的變化情況。1.3細胞內(nèi)ros的測定ros的測定按文獻報道方法[9]。具體如下：將細胞傳至激光共聚焦專用培養(yǎng)皿(corning公司)，靜止24h同步化后，krh緩沖液清洗3次，將各組細胞用10mg/lh2-dcfda避光孵育37℃15min，krh緩沖液再清洗3次，激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長488nm，發(fā)散波長505nm，攝像。測定各組熒光強度值，并以對照組熒光強度為基線，計算其他各實驗組相對熒光強度值。1.4實時定量rt-pcr檢測總rna提取按照trizol試劑說明書操作。取2μg總rna按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cdna。用實時定量pcr儀(美國mjresearch)檢測mrna的表達。定量pcr反應(yīng)體系：sybrgreenmix7.5μl，引物各0.3μl，cdna1.0μl，加三蒸水補足至15μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，92℃變性15s，60℃退火并延伸1min，共40循環(huán)，72℃終末延伸10min。pcr產(chǎn)物于12g/l瓊脂糖凝膠電泳fluorechemtm8900凝膠成像系統(tǒng)成像，以目的基因與內(nèi)參照gapdh積分吸光度的比值作為定量值進行統(tǒng)計分析。引物序列見表1。表1實時定量pcr的引物序列tab.1primersforrtq-pcr基因引物序列產(chǎn)物長度1.5western印跡按文獻報道方法[11]。取各組細胞，pbs洗2遍，加入細胞裂解液，收獲蛋白質(zhì)，4℃，12000r/min，離心15min，bradford法測定濃度。取適量的蛋白質(zhì)標(biāo)本，100g/l丙烯酰胺(sds)凝膠上電泳，電壓90v30min，140v60min。室溫恒壓100v維持90min。麗春紅染色硝酸素纖維膜，觀察蛋白轉(zhuǎn)移結(jié)果。tbst洗膜：室溫下10min。50g/l脫脂奶粉阻斷：室溫下輕搖60min。tbst洗膜：室溫下10min×3次?？乖贵w免疫反應(yīng)加入tbst稀釋的p47phox(1∶500)或gapdh(1∶1000)抗體孵育：4℃搖床輕搖過夜。tbst洗膜：室溫下10min×3次。分別與辣根過氧化物共軛的抗-兔的ⅱ抗(1∶1000)及hrp-anti-biotin抗體(1∶1000)室溫下孵育1h。tbst洗膜：室溫下10min×3次。顯影、檢測ecl發(fā)光。室溫下將膜浸于發(fā)光劑中1min后，取出膜甩去多余液體，將硝酸素纖維膜置于兩張干凈的保鮮膜之間，在暗室中對著x-線膠片曝光0.5～30min不等。膠片投入自動洗片機中沖洗和烤干。于凝膠成像系統(tǒng)進行目的蛋白及內(nèi)參照gapdh條帶灰度分析。1.6統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用spss17.0統(tǒng)計軟件進行分析。吸光度分析采用單位面積計算機圖像掃描值減去背景值的均值表示信號強度，以gapdh作為內(nèi)參照，計算兩者吸光度的比值，并以對照組或0h組作為基準(zhǔn)，計算其他各實驗組相對吸光度值，以±s表示。組間比較采用單因素方差分析和snk-q檢驗。p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.1大鼠腹膜間皮細胞的鑒定培養(yǎng)的大鼠腹膜間皮細胞呈菱形、橢圓形、多邊形等，細胞融合后，呈典型的鋪路石樣。免疫組化結(jié)果示細胞角蛋白(cytokeratin)陽性。在angⅱ10-7mol/l濃度作用12h后，rpmcs失去原來的整齊排列，細胞間隙增寬，但細胞形態(tài)未出現(xiàn)明顯的改變(圖1)。圖1腹膜間皮細胞的形態(tài)fig.1morphologyofperitonealmesothelialcells(×200)a：正常大鼠腹膜間皮細胞的形態(tài);b：血管緊張素ⅱ刺激后大鼠腹膜間皮細胞的形態(tài)。2.2angⅱ對ros產(chǎn)生的影響及黃芪的干預(yù)作用激光共聚焦顯微鏡觀察dcf熒光強度代表ros產(chǎn)生的量。正常對照組(a組)，angⅱ(10-7mol/l)組(b組)，angⅱ+agi(2g/ml)組(c組)，angⅱ+agi(1g/ml)組(d組)，在dcf孵育20min后，ros的產(chǎn)生情況如下圖(圖2)。統(tǒng)計學(xué)分析，腹膜間皮細胞經(jīng)angⅱ刺激20min后，ros產(chǎn)生較a組顯著增加(p0.05)。c組、d組均可顯著逆轉(zhuǎn)由angⅱ刺激誘導(dǎo)的ros產(chǎn)生增加，與b組比較，均差異顯著(p0.05)。c組與d組相比較差異顯著(p0.05)，說明ros產(chǎn)生的量與agi的濃度呈負相關(guān)(圖3)。圖2激光共聚焦顯微鏡dcf熒光fig.2dcffluorescentmodelunderlaserconfocalmicroscopea：正常對照組;b：angⅱ(10-7mol/l)組;c：angⅱ+agi(2g/ml)組;d：angⅱ+agi(1g/ml)。圖3angⅱ對ros產(chǎn)生的影響及黃芪的干預(yù)作用fig.3angiotensinⅱinfluencedrosproductionandeffectofastragalusintervention(n=4)a：正常對照組;b：angⅱ(10-7mol/l)組;c：angⅱ+agi(2g/ml)組;d：angⅱ+agi(1g/ml)組。avs.b，p0.05;bvs.c，p0.05;bvs.d，p0.05;cvs.d,p0.05。2.3angⅱ對nadph氧化酶亞基p47phox表達的影響及黃芪的干預(yù)作用實時定量rt-pcr結(jié)果顯示，angⅱ可誘導(dǎo)nadph氧化酶亞基p47phoxmrna表達上調(diào)，且以時間依賴模式上調(diào)，p47phoxmrna從4h開始有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)，至12h到達峰值(圖4)。westernblot結(jié)果顯示，angⅱ可誘導(dǎo)p47phox蛋白表達以時間依賴模式上調(diào)，從12h開始有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)，至48h達峰(圖5)。圖4angⅱ誘導(dǎo)nadph氧化酶亞基p47phoxmrna的表達情況fig.4angⅱinducednadphoxidasesubunitsp47phoxmrnaexpression(n=4)4、8、12、24hvs.0h，p0.05。圖5angⅱ誘導(dǎo)nadph氧化酶亞基p47phox蛋白的表達情況fig.5angⅱinducednadphoxidasesubunitsp47phoxproteinexpression(n=4)12、24、48、72hvs.0h，p0.05。pmcs經(jīng)agi預(yù)處理后，再行angⅱ體外刺激，可顯著逆轉(zhuǎn)由angⅱ誘導(dǎo)的nadph氧化酶亞基p47phoxmrna表達上調(diào)，c組、d組分別與b組比較，具有顯著差異(p0.05)，但未觀察到c組與d組有顯著性差異，agi對p47phoxmrna表達的抑制度不依賴濃度模式(圖6)。圖6agi預(yù)處理可顯著逆轉(zhuǎn)angⅱ誘導(dǎo)的nadph氧化酶亞基p47phoxmrna表達的上調(diào)fig.6agipretreatmentcouldreverseangⅱ’sinductionofnadphoxidasesubunitsp47phoxmrnaexpression(n=4)a：正常對照組;b：angⅱ(10-7mol/l)組;c：angⅱ+agi(2g/ml)組;d：angⅱ+agi(1g/ml)組;avs.b，p0.05;bvs.c，p0.05;bvs.d，p0.05。3討論腹膜纖維化是腹膜透析的重要并發(fā)癥之一，對其發(fā)病機制的不斷探討、尋找新的治療靶點及有效干預(yù)劑是腹膜透析進一步發(fā)展的迫切需要。angⅱ不僅作為一種血管活性物質(zhì)參與ras的活化效應(yīng)過程，而且局部產(chǎn)生的angⅱ作為一種重要的生長因子參與調(diào)節(jié)細胞的增值、凋亡及纖維化進程，是引起腹膜纖維化的重要因子之一[10-12]。nadph氧化酶是一種過氧化物酶,廣泛存在于吞噬細胞及非吞噬細胞，其催化產(chǎn)物活性氧(reactlveoxygenspecies,ros)參與機體防御和信息傳遞等許多生理過程。nadph氧化酶主要由5個亞基組成，包括2個膜亞基：gp91phox、p22phox;3個胞漿亞基：p47phox、p40pox、p67phox。另外，還有2個低分子量的gtp結(jié)合蛋白rap1a和rac2。當(dāng)細胞受到相應(yīng)刺激后,胞漿亞基p47phox被磷酸化激活，與p67phox結(jié)合并向胞膜轉(zhuǎn)位，與胞膜亞基結(jié)合組成有氧化活性的復(fù)合體，將氧催化為-o2-，進而產(chǎn)生一系列活性氧，造成細胞損傷。nadph氧化酶作為ros的調(diào)控酶，其胞漿亞基p47phox在多種組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著始動、樞紐性作用[13-15]。如前所述，色譜指紋圖譜證實黃芪注射液有穩(wěn)定的清除自由基、抗氧化的色譜峰，其拮抗高糖環(huán)境對腹膜間皮細胞的氧化應(yīng)激損傷的作用已被證實。該實驗研究中，在angⅱ作用下，ros的產(chǎn)生明顯增加，腹膜間皮細胞nadph氧化酶亞基p47phoxmrna和蛋白結(jié)果一致，均呈時間依賴模式的表達上調(diào)。我們應(yīng)用黃芪注射液預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，黃芪不僅可明顯減少由angⅱ誘導(dǎo)的腹膜間皮細胞ros的產(chǎn)生，而且可使nadph氧化酶亞基p47phox的表達降低。該實驗表明黃芪不僅能夠抑制nadph氧化酶的表達，而且可抑制其活性。由此我們推測，黃芪通過抑制腹膜間皮細胞nadph氧化酶的表達及其活性，從而減少腹膜間皮細胞ros的產(chǎn)生，阻斷ros在其中的信號傳導(dǎo)作用，及下游因子tgf-β的過度表達，減輕細胞的轉(zhuǎn)分化和細胞外基質(zhì)的積聚，增加細胞外基質(zhì)的降解而發(fā)揮其延緩腹膜纖維化的作用。綜上所述，長期腹膜透析患者，腹膜間皮細胞暴露于腹透液高糖、低ph值、乳酸鹽和葡萄糖降解物等多種生物不相容因素下，可導(dǎo)致腹膜纖維化，angⅱ、ros、nadph氧化酶均參與其中。腹膜間皮細胞經(jīng)angⅱ刺激，其ros產(chǎn)生明顯增多。ros產(chǎn)生增多與其調(diào)控酶——nadph氧化酶的表達上調(diào)密切相關(guān)。黃芪注射液能夠抑制nadph氧化酶的表達，減少腹膜間皮細胞ros的產(chǎn)生，從而減少腹膜的氧化應(yīng)激損傷，延緩腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展。【以下為參考文獻】\[1\]kiribayashik,masakit,naitot,etal.angiotensinⅱinducesfibronectinexpressioninhumanperitonealcellsviaerk1/2andp38mapk\[j\].kidneyint,2005,67:1126-1135.\[2\]nohh,leehb,yumr,etal.angiotensiniimediateshighglucose-inducedtgf-beta1andfibronectinupregulationinhpmcthroughreactiveoxygenspecies\[j\].peritdialint,2005,25(1):38-47.\[3\]karenb,karl-heinzk.thenoxfamilyofros-generatingnadphoxidases:physiologyandpathophysiology\[j\].physiolrev,2007,87:245-313.\[4\]hah,chamk,choihn,etal.effectsofperitonealdialysissolutionsonthesecretionofgrowthfactorsandextracellularmatrixproteinsbyhumanperitonealmesothelialcells\[j\].peritdialint,2002,22(2):171-177.\[5\]張磊，聶磊，王唯紅.黃芪注射液色譜指紋圖譜與抗氧化作用的相關(guān)分析\[j\].中藥材，2009,32(11):1757-1760.\[6\]舒靜，王怡，張曉云.黃芪注射液拮抗高糖腹膜透析液對腹膜間皮細胞緊密連接的影響\[j\].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007,21(4):50-53.\[7\]徐家云，王俊霞，孟曉青，等.黃芪注射液對大鼠腹膜透析效能及腹膜超微結(jié)構(gòu)的影響\[j\].河南科技大學(xué)學(xué)報,2006,24(2):81-83.\[8\]yangx,yer,kongq,etal.cd40isexpressedonratperitonealmesothelialcellsandupregulatesicam-1production\[j\].nephroldialtransplant,2004,19(6):1378-1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