乙肝丙肝核酸檢測(cè)的新平臺(tái)(臨床)

自動(dòng)化程度

199219961998200120032006MWPCOBASAMPLICOR

COBASAMPLIPREP

COBASAMPLICORMONITOR羅氏分子診斷標(biāo)準(zhǔn)化自動(dòng)化重復(fù)性COBASTAQMAN48COBAS

TAQMAN96一直以來(lái)，羅氏分子診斷對(duì)臨床核酸檢測(cè)市場(chǎng)提供完善可靠和創(chuàng)新性的產(chǎn)品及解決方案第一頁(yè)，共二十八頁(yè)。目前乙肝和丙肝臨床治療過(guò)程中遇到的主要問(wèn)題治療終點(diǎn)無(wú)法準(zhǔn)確判定有些病人經(jīng)一段時(shí)間治療后DNA/RNA檢測(cè)結(jié)果忽陰忽陽(yáng)，但臨床癥狀依然明顯不能及時(shí)預(yù)測(cè)耐藥（病毒學(xué)突破）核苷（酸）類(lèi)似物治療后病毒DNA/RNA快速下降至檢測(cè)限以下，不久卻發(fā)現(xiàn)病毒出現(xiàn)反跳療效的準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)？？？治療后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接決定預(yù)后問(wèn)題的根源在哪里？第二頁(yè)，共二十八頁(yè)。內(nèi)容HBV核酸檢測(cè)的現(xiàn)狀與需要HCV核酸檢測(cè)的現(xiàn)狀與需要羅氏的CAP/CTM能帶來(lái)什么益處總結(jié)第三頁(yè)，共二十八頁(yè)。HBVDNA監(jiān)測(cè)在抗病毒治療中的臨床應(yīng)用HBVDNA是監(jiān)測(cè)抗病毒治療響應(yīng)和時(shí)間的關(guān)鍵標(biāo)志物HBV治療的路線圖理念，為HBVDNA監(jiān)測(cè)用于臨床實(shí)踐提供了指導(dǎo)對(duì)用藥耐藥性的監(jiān)測(cè)（拉米夫定－YMDD，…）肝移植HBV復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的降低（術(shù)前，術(shù)后）……第四頁(yè)，共二十八頁(yè)。HBVDNA監(jiān)測(cè)的臨床應(yīng)用HBV治療路線圖

KeeffeE.ClinGastroHepatology2007;5:890-897.侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治療方案優(yōu)化，中國(guó)肝臟病雜志第五頁(yè)，共二十八頁(yè)。國(guó)產(chǎn)試劑現(xiàn)狀目前使用的國(guó)產(chǎn)試劑能解決的問(wèn)題，不能解決的問(wèn)題：HBV試劑盒說(shuō)明：500～5×107IU/mL較可信的測(cè)試范圍：104～5×107IU/mL對(duì)部分發(fā)生HBV病毒突變的病人無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)注：1IU/mL=1copy/mL第六頁(yè)，共二十八頁(yè)。內(nèi)容HBV核酸檢測(cè)的現(xiàn)狀與需要HCV核酸檢測(cè)的現(xiàn)狀與需要羅氏的CAP/CTM能帶來(lái)什么益處總結(jié)第七頁(yè)，共二十八頁(yè)。HCVDNA監(jiān)測(cè)在抗病毒治療中的臨床應(yīng)用HCV病毒感染是可治愈的疾病HCVRNA檢測(cè)可以有效指導(dǎo)臨床用藥治療的終點(diǎn)是核酸檢測(cè)為陰性（核酸檢測(cè)可以直接指導(dǎo)停藥時(shí)機(jī)）第八頁(yè)，共二十八頁(yè)。慢性HCV治療方案治療應(yīng)答名稱(chēng)描述快速病毒學(xué)應(yīng)答（RVR）4周時(shí)未檢測(cè)到HCVRNA早期病毒學(xué)應(yīng)答（EVR）-完全早期病毒學(xué)應(yīng)答（cEVR）未RVR，但12周時(shí)未檢測(cè)到HCVRNA-部分早期病毒學(xué)應(yīng)答（pEVR）未RVR，12周時(shí)HCVRNA拷貝數(shù)下降≥2log10，但仍檢測(cè)到HCVRNA沒(méi)有應(yīng)答12周時(shí)HCVRNA拷貝數(shù)下降<2log10治療結(jié)束（EOT）治療結(jié)束未檢測(cè)到HCVRNA持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（SVR）治療結(jié)束后24周，未檢測(cè)到HCVRNA反彈治療期間曾有HCVRNA低于檢出限，但尚未停藥即出現(xiàn)HCVRNA重新升高復(fù)發(fā)治療期間HCVRNA低于檢出限，但治療結(jié)束（停藥）后HCVRNA重新升高第九頁(yè)，共二十八頁(yè)。慢性HCV治療方案用藥12周早期病毒學(xué)反應(yīng)HCVRNA下降<2logHCV病毒檢測(cè)陰性HCV病毒檢測(cè)陽(yáng)性停藥HCV病毒檢測(cè)陰性治療到24周HCVRNA檢測(cè)HCVRNA下降>2log繼續(xù)治療至48周繼續(xù)治療至24周考慮停藥第十頁(yè)，共二十八頁(yè)。國(guó)產(chǎn)試劑現(xiàn)狀目前使用的國(guó)產(chǎn)試劑能解決的問(wèn)題，不能解決的問(wèn)題：HCV試劑盒說(shuō)明：500～5×107IU/mL較可信的測(cè)試范圍：104～5×107IU/mL注：1IU/mL=1copy/mL第十一頁(yè)，共二十八頁(yè)。內(nèi)容HBV核酸檢測(cè)的現(xiàn)狀與需要HCV核酸檢測(cè)的現(xiàn)狀與需要羅氏的CAP/CTM能帶來(lái)什么益處總結(jié)第十二頁(yè)，共二十八頁(yè)。全世界第一臺(tái)用于體外診斷的全自動(dòng)熒光定量分子診斷系統(tǒng)真正實(shí)現(xiàn)“樣品進(jìn)，結(jié)果出”全球安裝超過(guò)2,000臺(tái)，國(guó)內(nèi)安裝超過(guò)40臺(tái)COBASAmpliPrep/COBASTaqMan系統(tǒng)COBAS

AmpliPrep/COBASTaqMan48?系統(tǒng)COBASAmpliPrep/COBASTaqMan96?系統(tǒng)（帶連接系統(tǒng)）COBASAmpliPrep/COBASTaqMan96?系統(tǒng)

（無(wú)連接系統(tǒng)）第十三頁(yè)，共二十八頁(yè)。COBASAmpliPrep儀器簡(jiǎn)介全自動(dòng)系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)行核酸提取純化和PCR反應(yīng)體系配制基于MGP磁珠分離技術(shù)，確保高質(zhì)量的核酸提取純化最多72個(gè)樣品可以同時(shí)上機(jī)，運(yùn)行中可連續(xù)裝載上架，提高工作效率包括耗材、樣品、試劑均可以連續(xù)上樣第十四頁(yè)，共二十八頁(yè)。DNA或者RNA1.裂解、穩(wěn)定和去蛋白2.核酸捕獲病毒或細(xì)胞3.沖洗4.洗脫37°C孵育COBASAmpliPrep儀器

MGP磁珠分離技術(shù)室溫80°C孵育第十五頁(yè)，共二十八頁(yè)。取SPU槍頭樣本管/反應(yīng)管管蓋抓手樣本初始體積感應(yīng)器取試劑鋼針CAP機(jī)械臂介紹樣本管/反應(yīng)管結(jié)構(gòu)第十六頁(yè)，共二十八頁(yè)。COBAS

TaqMan/COBASTaqMan48分析儀簡(jiǎn)介檢測(cè)通量可達(dá)4*24測(cè)試獨(dú)立的24孔熱循環(huán)儀TaqMan48有2個(gè)模塊，TaqMan96有4個(gè)模塊最多可同時(shí)進(jìn)行4個(gè)不同的分析檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，核酸擴(kuò)增和檢測(cè)全部自動(dòng)完成實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)，卓越的檢測(cè)性能，靈敏度高和特異性好，動(dòng)態(tài)范圍寬第十七頁(yè)，共二十八頁(yè)。HBV-DNA定量測(cè)試用于藥品FDA注冊(cè)試驗(yàn)通用名商品名

FDA批準(zhǔn)日期關(guān)鍵的HBV-DNA測(cè)試Interferonalfa-2bα-2b干擾素

INTRON?A1991N/ALamivudine拉米夫定EPIVIR-HBV?1998雜交研究解決方案

1Adefovirdipivoxil阿德福韋酯HEPSERA?2002AmplicorMonitor2Entecavir恩替卡韋BARACLUDE?2005CobasAmplicor3Peginterferonalfa-2a聚乙二醇干擾素α-2aPEGASYS?2005CobasAmplicor4Telbivudine替比夫定TYZEKA?2006CobasAmplicor5Tenofovir替諾福韋VIREAD(HIV)Phase3CobasTaqMan6

INTRON?A(Interferonalfa-2b)[packageinsert].Schering-PloughCorp.Kenilworth,NJ2.EPIVIR-HBV?(Lamivudine)[packageinsert]GlaxoSmithKline,ResearchTrianglepark,NC3.HEPSERA?(Adefovirdipivoxil)[packageinsert]GileadSciences.FosterCity,CA4.Pegasys(Peginterferonalfa-2a)[packageinsert].Hoffmann-LaRocheInc.Nutley,NJ5.TYZEKA?(Telbivudine)[PackageInsert].NovartisPharmaceuticalsCorp.EHanover,NJ6.MarcellinPetal.HepDART2007MeetingAbstract63,Dec9-132007,Lahaina,HI第十八頁(yè)，共二十八頁(yè)。國(guó)外發(fā)表的文獻(xiàn)Evaluationofinitialvirologicalresponsetoadefoviranddevelopmentofadefovir-resistantmutationsinpatientswithchronichepatitisB.Gallegoetal.,JournalofViralHepatitis,2008,15,392–398Evaluationofanautomated,highlysensitive,real-timePCR-basedassay(COBASAmpliprepTM/COBASTaqManTM)forquantificationofHCVRNA.ChristophSarrazinaetal.,JournalofClinicalVirology,2008,43,162–168COBASAmpliPrep-COBASTaqManHepatitisBVirus(HBV)Test:aNovelAutomatedReal-TimePCRAssayforQuantificationofHBVDNAinPlasma.TizianoAlliceetal.,JournalofClinicalMicrobiology,Mar.2007,p.828–834EvaluationoftheCOBASAmpliPrep-totalnucleicacidsolation-COBASTaqManhepatitisBvirus(HBV)quantitativetestandcomparisontotheVERSANTHBVDNA3.0assay.RonsinCetal.,JournalofClinicalMicrobiology2006vol.44(no.4)ComparisonoftheCOBASTaqManTMHBVTestWiththeCOBASAmplicorMonitorTMTestforMeasurementofHepatitisBVirusDNAinSerum.SimonSiu-ManSumetal.,JournalofMedicalVirology2005,77:486–490HepatitisBvirus(HBV)genotypedeterminationbytheCOBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest,v2.0inserumandplasmamatrices.GoedelSetal.,JournalofClinicalVirology2009Jul;45(3):232-6ComparisonofVersantHBVDNA3.0andCOBASAmpliPrep-COBASTaqManassaysforhepatitisBDNAquantitation:Possibleclinicalimplications.GARBUGLIAA.R.etal.,Journalofvirologicalmethods2007,vol.146,no1-2,pp.274-280PerformanceoftheCobasAmpliPrep/CobasTaqManReal-TimePCRAssayforHepatitisBVirusDNAQuantification.Ste′phaneChevaliezetal.,JournalofClinical,May2008,p.1716–1723……第十九頁(yè)，共二十八頁(yè)。HBV的定量檢測(cè)性能指標(biāo)國(guó)產(chǎn)HBV試劑CAP/CTMHBV靈敏度(LOD)500IU/mL？12IU/mL檢測(cè)范圍104～5×107IU/mL54-1.1×108IU/mL定量方法外標(biāo)法定量?jī)?nèi)標(biāo)法定量其它對(duì)部分發(fā)生HBV病毒突變的病人無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)涵蓋亞型:A-G加強(qiáng)pre-core突變檢測(cè)注：國(guó)產(chǎn)試劑1IU/mL=1copy/mL第二十頁(yè)，共二十八頁(yè)。HCV的定量檢測(cè)性能指標(biāo)國(guó)產(chǎn)HCV試劑CAP/CTMHCV靈敏度(LOD)500IU/mL？15IU/mL檢測(cè)范圍104～5×107IU/mL43–6.9×107IU/mL定量方法外標(biāo)法定量?jī)?nèi)標(biāo)法定量其它未知1-6型(能區(qū)分0.5log濃度變化)第二十一頁(yè)，共二十八頁(yè)。定量原理

外標(biāo)法定量（國(guó)產(chǎn)試劑）使用一組（4管）外部標(biāo)準(zhǔn)品定量，分別為5×104到5×107IU/mL未考慮各患者血液成分間的差異性對(duì)結(jié)果的影響第二十二頁(yè)，共二十八頁(yè)。定量原理

內(nèi)標(biāo)定量InternalQuantitationStandard(CAP/CTM)內(nèi)標(biāo)是已知拷貝數(shù)的人工構(gòu)建核酸，加入每一反應(yīng)管，與靶核酸競(jìng)爭(zhēng)擴(kuò)增，管內(nèi)定量可提示反應(yīng)是否存在反應(yīng)抑制，避免假陰性結(jié)果充分考慮管間反應(yīng)效率的差異，得到可靠精確的結(jié)果第二十三頁(yè)，共二十八頁(yè)。COBASAmpliPrep/COBASTaqMan系統(tǒng)封閉樣品管輸入，封閉PCR管輸出標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性純化好的核酸主反應(yīng)液PCR反應(yīng)體系的配制試劑、樣品和耗材的裝載上機(jī)樣品處理單元K-槍頭K-管樣品試劑第二十四頁(yè)，共二十八頁(yè)。Branchburg生產(chǎn)廠房

羅氏投資超過(guò)1.5億美金，建成全球最大分子診斷試劑生產(chǎn)基地

目前每月生產(chǎn)14萬(wàn)套試劑

第二十五頁(yè)，共二十八頁(yè)。羅氏分子診斷嚴(yán)格的生產(chǎn)和質(zhì)控體系

為整個(gè)行業(yè)設(shè)定了高標(biāo)準(zhǔn)1.原料嚴(yán)格把關(guān)3.GMP生產(chǎn)2.原料質(zhì)檢4.GMP生產(chǎn)6.成品質(zhì)檢5.試劑盒成品7.資料入檔第二十六頁(yè)，共二十八頁(yè)。COBASAmpliPrep/COBASTaqMan

全自動(dòng)熒光定量分子診斷系統(tǒng)的應(yīng)用