2023年質(zhì)粒DNA的提取及其瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)告

一、實(shí)驗(yàn)名稱：質(zhì)粒ＤＮA的提取與純化,DNA瓊脂糖凝膠電泳二、實(shí)驗(yàn)原理:１.質(zhì)粒ＤNA的提取:質(zhì)粒是一類存在于幾乎所有細(xì)菌等微生物中染色體之外（細(xì)胞質(zhì)中）呈游離狀態(tài)的雙鏈、閉環(huán)的DＮA分子，可以自主復(fù)制和穩(wěn)定遺傳,以超螺旋形式存在,是最常用的基因克隆載體。除質(zhì)粒外，大腸桿菌中還具有基因組ＤNＡ、各種RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì),因此需要裂解細(xì)胞并除去蛋白質(zhì)和染色體ＤNＡ等物質(zhì)才干分離純化出質(zhì)粒ＤＮＡ。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多,其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DＮＡ的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)使用堿裂解法，即運(yùn)用SolutioｎⅠ、Ⅱ、Ⅲ三種溶液分離提取質(zhì)粒ＤＮA.其原理如下。(1)堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒ＤNA的原理：堿裂解法提取質(zhì)粒DＮA是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA之間變性與復(fù)性的差異來分離質(zhì)粒ＤNA,達(dá)成分離提純質(zhì)粒DNＡ的目的。在pH值高達(dá)1２.６的堿性條件下，線性的ＤNＡ因氫鍵斷裂,雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，盡管在這樣的條件下,共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵會被斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈互相纏繞，不會完全分離。當(dāng)加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)ｐH至中性時,共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA復(fù)性,恢復(fù)其天然構(gòu)象，以可溶狀態(tài)存在于液相中；而線性的染色體ＤNA由于兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開、分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜而互相纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與不穩(wěn)定的大分子RNA、變形的蛋白質(zhì)以及細(xì)菌碎片等一起沉淀而被除去。進(jìn)一步用酚、氯仿使蛋白質(zhì)變性去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，然后用無水乙醇沉淀,即可獲得純化的質(zhì)粒DNA。SoｌｕｔionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三種溶液以及無水乙醇沉淀DNA的具體作用和原理如下。（2）四種溶液作用及原理：①ＳolutionＩ的作用：懸浮大腸桿菌菌體，增長溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg２+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，在溶液I中加入EＤTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價(jià)金屬離子都螯合掉，從而起到克制ＤNA酶對DNA的降解和克制微生物生長的作用。此外也可保證溶菌酶活性。②SoluｔionＩＩ的作用：提供堿性條件,pH高達(dá)１２.6，使大腸桿菌瞬間裂解，促使染色體DNA和質(zhì)粒ＤNＡ變性。所含離子型表面活性劑十二烷基酸鈉(SＤS）可使細(xì)胞膜、核膜發(fā)生破裂，充足溶解膜蛋白。同時,磺酸基與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而變形沉淀。③SolutioｎI(lǐng)IＩ的作用:為ＫAｃ－HＡｃ緩沖液。該溶液所具有的高濃度鉀離子與溶液體系中的十二烷基磺酸鈉發(fā)生反映形成十二烷基磺酸鉀，從而將與之結(jié)合的絕大部分大腸桿菌蛋白質(zhì)以及很長的基因組ＤNA一起沉淀,與質(zhì)粒分離開來;此外溶液III所具有的醋酸中和溶液Ⅱ的強(qiáng)堿性,使pH降至中性,由于長時間的堿性條件會打斷DＮＡ；基因組DＮA一旦發(fā)生斷裂,只要是50－100kｂ大小的片段,就沒有辦法再被PＤS共沉淀,這樣就跟質(zhì)粒DＮA共存了。并且在整個質(zhì)粒DＮＡ的提取過程中，沉淀DNA時用無水乙醇及在高鹽、低溫條件下進(jìn)行都是為了用化學(xué)或物理手段將基因組DNＡ分子和蛋白質(zhì)發(fā)生變性、在體系中的溶解度減少,較充足的分離提純出實(shí)驗(yàn)所需的質(zhì)粒DNA④無水乙醇的作用：是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀ＤNＡ的方法。ＤＮＡ溶液是DＮA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在,當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪DNA周邊的水分子,使DNＡ失水而易于聚合.一般實(shí)驗(yàn)中,是加2倍體積的無水乙醇與DNＡ相混合,其乙醇的最終含量占67%左右。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反映,對DNA很安全，因此是抱負(fù)的沉淀劑。也可以用０．6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DＮA。2.質(zhì)粒DNＡ的瓊脂糖凝膠電泳：運(yùn)用DＮＡ分子在瓊脂糖凝膠中泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)而達(dá)成分離、鑒定DＮＡ的目的。DNＡ分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液環(huán)境中帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DＮＡ分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即ＤNＡ分子自身的構(gòu)型和大小。不同的分子由于所帶電荷、分子質(zhì)量或者構(gòu)型的不同,在同一電泳系統(tǒng)中的泳動速度不同，因而可以彼此分離，并檢測起分子量大小。未切割的質(zhì)粒DNＡ在其泳道上也許會出現(xiàn)幾個條帶，之所以這樣是由于質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移距離是由其分子構(gòu)象及