普通儀和熒光定量儀的使用

普通儀和熒光定量儀的使用第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日PartI中心PCR(polymerasechainreaction)儀簡介PartIIPCR原理PartIII普通PCR儀操作規(guī)程PartⅣ熒光定量PCR原理PartⅤ熒光定量PCR儀操作規(guī)程第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日PartI中心PCR儀簡介熒光定量PCR儀Rotorgene3000普通PCR儀GeneAMPSystem9700第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日PartIIPCR原理AAAA蛋白/酶DNAmRNA蛋白中心法則基因表達轉(zhuǎn)錄水平翻譯水平基因水平（Realtime）RT-PCRWesternblotPCR核酸的功能是儲存和轉(zhuǎn)移遺傳信息，指導和控制蛋白質(zhì)的合成；而蛋白質(zhì)的主要功能是進行新陳代謝活動和作為細胞結(jié)構(gòu)的組成成分。

第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR概念利用DNA聚合酶、一對引物和四種dNTP（三磷酸脫氧核苷酸），對模板DNA反復多次地進行復制，從而得到大量擴增產(chǎn)物的反應過程，稱為PCR。PartIIPCR原理第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日PartIIPCR原理PCR反應五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）Mg2+（magnesium）模板（template）第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日PartIIPCR原理PCR擴增的基本反應步驟1、變性：加熱至95oC左右，使模板DNA變性。2、退火：降低溫度至適合的溫度（55oC左右，引物與模板DNA的互補序列配對結(jié)合。3、延伸：溫度在70oC左右時，TaqDNA聚合酶從引物3'端催化復制鏈以5'

-3'方向延伸。第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1-3步25-30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PartIIPCR原理第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日PartIIPCR原理PCR原理PCR的理論方程：Y=x×(1+Ev)n

Y：擴增物數(shù)量；X：起始模板數(shù)量；Ev：擴增效率；n：擴增循環(huán)數(shù)第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日PartIII普通PCR儀操作規(guī)程開機操作：打開PCR儀電源開關(guān)；向后平推PCR儀頂蓋，放入PCR薄壁管。向前平推PCR儀頂蓋，并均勻用力將反扣部分壓下。注意：9700PCR儀必須使用圓頭的PCR薄壁管。第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程GeneAmpPCRSystem9700Version3.05User:***RunCreatEditUtilUserF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程SelectUserName<<pre>>cqllyf

……AcceptNewEditDeleteCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程UserName___UseENTERkeytoselectacharacter.AcceptBackspCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStopabcdefghijklmnopqrstuvwxyz第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程MethodsizelastusedExp000qin0903/01/06Exp001qin1904/10/06StartViewUserSortCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程StartReturnF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop1Hld3Tmp35Cycles2Holds94.03:0094.00:2055.00:2072.00:2072.07:004.08第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程MethodsizelastusedExp000qin0903/01/06Exp001qin1904/10/06EditViewUserSortCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR儀軟件操作指南：PartIII普通PCR儀操作規(guī)程EditReturnF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop1Hld3Tmp35Cycles2Holds94.03:0094.00:2055.00:2072.00:2072.07:004.08第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日關(guān)機操作：實驗結(jié)束后點擊Exit至出現(xiàn)主界面，關(guān)閉PCR儀電源開關(guān)；均勻用力將反扣部分抬起，向后平推PCR儀頂蓋，取出PCR薄壁管。向前平推PCR儀頂蓋。PartIII普通PCR儀操作規(guī)程第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日

首先，傳統(tǒng)的PCR檢測方法在測定PCR擴增產(chǎn)物前需打開反應管，容易造成產(chǎn)物污染，成為“假陽性”的主要來源。實時PCR在擴增過程中動態(tài)檢測，完全以閉管方式進行，不僅操作簡便，也杜絕了產(chǎn)物污染源。其次，傳統(tǒng)PCR都是在PCR到達平臺期后進行檢測。PCR經(jīng)過指數(shù)期后，對反應條件的變化十分敏感，擴增到達平臺期的信號強度重現(xiàn)性很差。實時PCR方法則在指數(shù)擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此具有重復性。PartIV熒光定量PCR原理第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB內(nèi)插染料法插至雙鏈DNA，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強度PCR循環(huán)=雙鏈DNA=染料=熒光后來用與雙鏈DNA有更強結(jié)合力的SYBRGreenI取代EBPartIV熒光定量PCR原理第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日激發(fā)光Ct值PartIV熒光定量PCR原理使用RealTimePCR擴增裝置實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行分析的方法。第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日PartIV

熒光定量PCR原理實時定量PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和熒光檢測技術(shù)的結(jié)合

通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控PCR反應過程，通過儀器和相應的軟件分析結(jié)果，對待測樣品的初始模板進行定量或定性分析。第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日熒光定量PCR標記方法內(nèi)摻式染料

SYBRGreenI序列特異性探針

Taqman MolecularBeacons

FRET引物特異性探針 Amplifluor(Intergen)PartIV熒光定量PCR原理第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日SYBR-GreenI

dsDNA的內(nèi)插染料是一種能插入到雙鏈DNA并發(fā)出強烈熒光的化學物質(zhì)，其熒光強度的增加與dsDNA的數(shù)量成正比。如SYBRGreenⅠ染料，當它沒有結(jié)合上雙鏈DNA時，只發(fā)出相對弱的熒光；然而，當它一旦插入到雙鏈DNA里時，熒光信號將會強烈地增加，從而根據(jù)熒光信號的增強來計算PCR擴增產(chǎn)物的增加。PartIV熒光定量PCR原理第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

PartIV熒光定量PCR原理第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

PartIV熒光定量PCR原理第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日雙標記探針（TaqmanProbe）

5’端標記熒光分子（如：FAM），在3’端標記一個吸收或淬滅熒光的分子（如：TAMRA），這樣5’端激發(fā)出的熒光會被3’端的分子淬滅或吸收掉，所以開始時，儀器并不能檢測到熒光。由于Taq聚合酶同時具有5’端外切酶的活性，在PCR反應的延伸階段，Taq酶會把5’端的熒光分子切下，使其與3’端吸收或淬滅熒光的分子分開，儀器就會檢測到熒光信號。每一個循環(huán)，隨著PCR擴增產(chǎn)物的增加，熒光信號會增強，從而根據(jù)熒光信號的增強來計算PCR產(chǎn)物擴增量的增加。PartIV熒光定量PCR原理第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitationPartIV熒光定量PCR原理第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日RealTimePCR引物設(shè)計目的是獲得目的基因，對非特異性反應和引物二聚體要求不嚴格。目的是讓目的基因按照理論值進行擴增，對非特異性反應和引物二聚體要求嚴格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設(shè)計要求不同=>對引物設(shè)計要求嚴格普通PCR引物RealTimePCR引物第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日兩條引物的Tm值盡量接近，應用專用軟件計算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)

★GC含量Primer長度80-150bp(盡量限制在300bp以內(nèi))★擴增片段大小★17-25base使用BLAST檢索，確認引物特異性★★★特異性

△

引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3base以上的互補序列

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引物3’末端避免2base以上的互補序列★★★互補性3’末端序列

△

整體上堿基不能過偏

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個別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)

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避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)★序列★

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3’末端避免GCrich或ATrich

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3’末端堿基最好為G或C

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3’末端堿基盡量避免為T盡量在Exonjunction上設(shè)計引物，限制基因組DNA擴增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物設(shè)計原則第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日線性關(guān)系、擴增效率確認檢測靈敏度確認35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增。NoTemplateControl確認30Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生。相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98反應性能確認第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日1、開始運行儀器 打開PCR儀底座開關(guān)，再打開定量PCR儀檢測器開關(guān)。實驗前先讓系統(tǒng)預熱30分鐘，打開電腦，啟動iQ5軟件。2、放置樣品 將PCR反應體系加入到0.2ml的薄壁管或96孔板中，蓋上管蓋。注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手