不產(chǎn)孢內(nèi)生菌菌株的鑒定方法研究與討論,微生物論文

不產(chǎn)孢內(nèi)生菌菌株的鑒定方法研究與討論,微生物論文內(nèi)生真菌(Endophyticfungi)廣泛存在于健康植物組織器官中,具有極其豐富的物種多樣性和功能多樣性。對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定是內(nèi)生真菌研究中一項(xiàng)必不缺少的基礎(chǔ)性工作,但很多菌株在人工培養(yǎng)條件下缺乏(或不易構(gòu)成)有性、無性繁衍構(gòu)造,不產(chǎn)孢菌株占有相當(dāng)高的比例;同時(shí)經(jīng)常會(huì)分離到一些稀有、特殊(或新的分類單元)的菌株。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),近20年來以內(nèi)生真菌為標(biāo)本命名、建立的新屬至少有15個(gè)。近期在橡膠樹內(nèi)生真菌資源挖掘中,還建立了一個(gè)子囊菌的新綱(Xolonomycetes),足以凸顯內(nèi)生真菌在全球真菌生物多樣性組成中的特殊地位。從低等菌中的接合菌、卵菌到高等真菌中的子囊菌和擔(dān)子菌都可作為植物內(nèi)生菌。對(duì)于研究內(nèi)生真菌天然產(chǎn)物、生態(tài)學(xué)功能等領(lǐng)域的專家來講,怎樣快速、準(zhǔn)確鑒定物種(至少在屬的水平)是一項(xiàng)既困難又重要的任務(wù)。筆者在2018年對(duì)中國科學(xué)院阜康荒漠生態(tài)站周邊的荒漠鹽生植物內(nèi)生真菌資源進(jìn)行了調(diào)查研究。本文就華而不實(shí)一株不產(chǎn)孢內(nèi)生菌菌株的鑒定方式方法進(jìn)行了研究和討論,希望為今后內(nèi)生真菌基礎(chǔ)研究提供一些思路和參考。1、材料與方式方法1.1菌株材料Tricharinastriispora(菌株保藏號(hào):MUCL41297)由比利時(shí)菌種保藏中心(BCCM)饋贈(zèng);Tricharinaochroleuca(菌株保藏號(hào):CBS238.85)購自荷蘭皇家科學(xué)院真菌多樣性研究中心(CBS)。小灌木-白刺屬(Nitraria)荒漠植物內(nèi)生真菌菌株BCS-1由作者實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。1.2內(nèi)生真菌菌株BCS-1培養(yǎng)性狀和顯微形態(tài)觀察將內(nèi)生真菌菌株BCS-1分別接種在馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)和麥芽粉瓊脂培養(yǎng)基(MEA)平板上(直徑9cm),20℃黑暗培養(yǎng)3-12d,觀察菌落生長速度、培養(yǎng)性狀;在光學(xué)顯微鏡(OlympusBX51)下觀察和記錄顯微形態(tài)特征。1.3內(nèi)生真菌菌株BCS-1的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析菌株總基因組DNA提取采用MultisourceGenomicDNAMiniprep試劑盒(Axygen公司)。引物5.8SR(5-TCGAT-GAAGAACGCAGCG-3)和LR7(5-TACTACCACCAA-GATCT-3)擴(kuò)增核糖體RNA(rRNA)28S大亞基(LSU)的部分序列;測(cè)序引物為LR0R(5-ACCCGCTGAACTTAAGC-3)、LR5(5-TCCTGAGGGAAACTTCG-3)和LR7。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1-5.8S-ITS2)擴(kuò)增采用引物ITS1F(5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3);RNA聚合酶第二亞基基因(RPB2)片段用RPB2-5f(5-GAYGAYMGWGAT-CAYTTYGG-3)和RPB2-7cr(5-CCCATRGCTTGYTTRC-CCAT-3)引物擴(kuò)增。兼并堿基代碼為:Y=T/C;M=A/C;W=T/A;R=A/G。PCR體系組成如下(50l):5l10PCRbuffer、3l25mmol/LMg2+、4l25mmol/LdNTP、0.5l引物(50mol/L)、5lDNA模板(10~100ng)、0.3lEx-Taqpolymerase和31.7l去離子H2O。PCR擴(kuò)增反響條件為:94℃預(yù)變性4min,每個(gè)循環(huán)為94℃40s、55℃退火1min(LSU基因調(diào)整為58℃、72℃延伸1.5min,最后72℃延伸10min,共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。3個(gè)菌株、3個(gè)基因共9條DNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。用BLAST搜索工具獲得每個(gè)基因多個(gè)匹配的序列記錄,隨后進(jìn)行多序列比對(duì)(CLUSTALX軟件)。用GENEDOC軟件進(jìn)行適當(dāng)修正并去除序列兩端不準(zhǔn)確部分,華而不實(shí)RPB2序列的起始核苷酸以編碼正確氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行界定。用PHYLIP軟件包、采用鄰接法(neighborjoininganalysis,NJ)構(gòu)建3個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。進(jìn)化樹分支上的自展支持值(Bootstrap)由SEQBOOT、DNADIST、NEIGHBOR和CONSENSUS等相關(guān)命令獲得,重復(fù)次數(shù)為1000次。2、結(jié)果與分析2.1內(nèi)生真菌菌株BCS-1培養(yǎng)性狀描繪敘述和顯微形態(tài)特征BCS-1菌株生長速度較快,20℃黑暗培養(yǎng)3d后,在PDA、MEA培養(yǎng)基上的菌落直徑分別到達(dá)5.5cm和4.3cm(平均值)。培養(yǎng)1w后菌落即可覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿,在PDA平板上菌落呈淡褐色,而在MEA平板上呈深褐色,培養(yǎng)后期菌落可構(gòu)成不明顯的環(huán)形帶構(gòu)造(圖1)。BCS-1菌株在人工培養(yǎng)基上不產(chǎn)生無性繁衍構(gòu)造(如分生孢子等)。顯微觀察結(jié)果表示清楚,菌絲有隔,寬5~10m。在菌絲側(cè)面(偶然在菌絲頂端)近90方向產(chǎn)生膨大的念珠狀細(xì)胞(Monilioidcells),這些細(xì)胞通常聚集在一起,在菌落表示清楚構(gòu)成肉眼可見的孢子堆(Sporodochia)構(gòu)造。念珠狀細(xì)胞呈現(xiàn)多樣化形態(tài),有亞球形、檸檬形狀、梨形或不規(guī)則形。多數(shù)細(xì)胞透明狀,大小不一,富含油球,直徑最大可達(dá)14m。一般頂端細(xì)胞最大,呈淡褐色,細(xì)胞壁薄,油滴較小,細(xì)胞破壁后釋放出來。念珠狀細(xì)胞不分枝或二叉分支,少數(shù)可構(gòu)成一級(jí)分支(圖2)。2.2基于ITS、RPB2和LSU的內(nèi)生真菌菌株BCS-1多基因系統(tǒng)發(fā)育分析首先以BCS-1菌株的ITS基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了BLAST搜索,表示清楚BCS-1菌株與子囊菌火絲菌科(Py-ronemataceae)的地孔菌屬(Geopora)真菌最接近,然而序列類似性只要90%,表示清楚該菌株可能是稀有種(或潛在新種)。LSU基因序列的BLAST結(jié)果顯示前10個(gè)最佳匹配記錄均從屬于火絲菌科。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征并查閱相關(guān)文獻(xiàn),初步以為BCS-1菌株與火絲菌科的Tricharina屬真菌的無性型(Asco-rhizoctonia)最為接近。為了驗(yàn)證鑒定的準(zhǔn)確性,有必要研究該菌株的分子系統(tǒng)學(xué)。然而GenBank中有關(guān)Tricharina物種的基因數(shù)據(jù)還特別有限,因而本文選擇2個(gè)Tricharina物種(標(biāo)準(zhǔn)菌株)為試驗(yàn)材料,以LSU、ITS和RPB2三個(gè)基由于標(biāo)記,分析BCS-1菌株與Tricharina相關(guān)種及火絲菌科其它屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。LSU基因系統(tǒng)發(fā)育分析表示清楚BCS-1菌株與T.striispora、T.ochroleuca和T.praecox等遺傳關(guān)系較近,在同一進(jìn)化分支(自展支持率100%),而與形式種T.gilva遺傳關(guān)系較遠(yuǎn);RPB2和ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析也支持了以上結(jié)果(自展支持率100%)。固然LSU和ITS系統(tǒng)樹表示清楚Tricharina不是單譜系類群,與Geopora遺傳關(guān)系近期,但以上結(jié)果確定BCS-1菌株屬于Tricharina的一個(gè)無性型菌物(圖3)。2.3鑒定結(jié)果根據(jù)Tricharina屬無性型形態(tài)學(xué)特征的描繪敘述并結(jié)合分子鑒定結(jié)果,將BCS-1菌株鑒定為Ascorhizoctoniapraecox。根據(jù)一種真菌一個(gè)名稱(Onefungus=Onename)命名法規(guī),將BCS-1菌株最后命名為Tricharinapraecox。T.gilva是當(dāng)前我們國家報(bào)道的唯逐一個(gè)種,因而T.praecox還是我們國家的新記錄種。3、討論物種鑒定是真菌學(xué)研究中的一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作。菌物分類工作者通常對(duì)某一特定類群(科或?qū)俚乃?進(jìn)行具體深切進(jìn)入分析,如重要植物真菌病害(鐮刀菌、炭疽菌等)或生態(tài)型類群(水生真菌、蟲生真菌、暗色絲孢菌等),因而積累了豐富的研究材料(如文獻(xiàn)資料、實(shí)物標(biāo)本和基因數(shù)據(jù)等)。植物內(nèi)生真菌鑒定工作則不同,同一種植物內(nèi)生真菌的組成可能涵蓋了擔(dān)子菌和子囊菌中的多個(gè)科屬,而且很多種類在培養(yǎng)基中不產(chǎn)生無性或有性繁衍構(gòu)造。當(dāng)前內(nèi)生真菌的鑒定工作還比擬粗放,怎樣快速、準(zhǔn)確鑒定物種值得深切進(jìn)入研究。筆者以為不管內(nèi)生真菌純培養(yǎng)物產(chǎn)孢與否,核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS基因序列分析是內(nèi)生真菌分子鑒定的不二選擇。僅以經(jīng)典形態(tài)學(xué)特征為根據(jù)進(jìn)行鑒定費(fèi)時(shí)且不完全可靠,尤其不適用于內(nèi)生真菌鑒定工作。在本研究中,假如僅根據(jù)菌株培養(yǎng)性狀和顯微特征,可能誤將其鑒定為絲核菌類擔(dān)子菌如角擔(dān)菌(Ceratobasidiumpseudocornigerum)和(Oliveorhizaana-pauxilla)等。StrobelGA等結(jié)合分子證據(jù)并比擬標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)一株產(chǎn)揮發(fā)性氣體(碳?xì)浠衔?的內(nèi)生真菌進(jìn)行了更正和重新命名。ITS序列已經(jīng)被公以為是鑒定菌物的通用條形碼。與其他基因數(shù)據(jù)相比擬(RPB2、SSU等),GenBank數(shù)據(jù)庫中真菌ITS序列信息是非常豐富的。盡管有研究以為在數(shù)據(jù)庫中有很多序列注釋錯(cuò)誤或序列本身存在問題,但BLAST搜索結(jié)果一般能夠給出有益的參考信息,將目的菌株的分類地位縮小范圍,最后結(jié)合形態(tài)學(xué)特征(假設(shè)能觀察到)鑒定到屬或種。當(dāng)對(duì)內(nèi)生真菌ITS基因序列進(jìn)行BLAST搜索時(shí),可能存在下面兩種特殊情況:第一,與數(shù)據(jù)庫記錄匹配程度較低(85~90%)甚至更低,講明目的菌株可能是稀有種類(已經(jīng)知道物種但數(shù)據(jù)庫缺少該菌物的ITS序列)或者代表新的分類單元。本文中BCS-1菌株的BLAST結(jié)果屬于前者;而以內(nèi)生真菌為標(biāo)本建立的新屬如Muscodor、Edenia、Aurosphaeria和Mi-cronematobotrys等則屬于后者。第二,某些真菌ITS基因序列的多個(gè)最佳匹配記錄在分類地位不并不歸在同一個(gè)屬甚至相差甚遠(yuǎn),可能有下面原因:(1)數(shù)據(jù)庫部分匹配序列確屬注釋錯(cuò)誤;(2)目的菌株可能不是單譜系類群(monophyleticgroup);(3)目的菌株與近緣種的ITS序列高度類似,表示清楚此時(shí)ITS基因不是理想的條形碼或者系統(tǒng)發(fā)育分析的優(yōu)良標(biāo)記。以上情況表示清楚基于真菌ITS序列的分子鑒定也有一定的局限性。為了解決這些問題,能夠選擇進(jìn)化上更保守的核糖體非編碼基因如SSU、LSU或編碼基因或特殊分子標(biāo)記綜合分析,根據(jù)系譜一致性系統(tǒng)發(fā)生種辨別(GCPSR)原理科學(xué)界定物種。如RPB2和翻譯延長因子(EF-1)廣泛應(yīng)用于子囊菌種水平的研究;鏈格孢過敏元基因Alta1能很好地解決鏈格孢菌(Alternaria)的系統(tǒng)發(fā)育。隨著真菌全基因組測(cè)序的快速發(fā)展,利用生物信息學(xué)手段能夠?qū)⒁恍┻M(jìn)化速率適度的單拷貝編碼蛋白基因開發(fā)成新的分子標(biāo)記。值得注意的是:傳統(tǒng)菌物分類通常需要獲得獨(dú)立來源的多個(gè)菌株進(jìn)行分類學(xué)特征的調(diào)查。然而單個(gè)菌株(Singletons)或單個(gè)操作分類單元(OTUs)在內(nèi)生真菌多樣性研究中特別普遍;經(jīng)歷體驗(yàn)還表示清楚很多具有強(qiáng)活性的內(nèi)生真菌菌株往往只分離到一份標(biāo)本。在這里情況下,通太多個(gè)基因的系統(tǒng)學(xué)分析并結(jié)合幾個(gè)關(guān)鍵形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定是可行的。結(jié)合本文的研究實(shí)例并綜合以上討論,我們歸納了內(nèi)生真菌菌種鑒定的一般策略:簡(jiǎn)言之,就是先分子后形態(tài)(圖4)。固然內(nèi)生真菌種類繁多,特殊無孢內(nèi)生菌也相當(dāng)普遍,鑒定工作給非菌物分類學(xué)專家?guī)硪欢ǖ奶魬?zhàn)性。但隨著Tri-chOKEY2、FUSARIUM-IDv.1.0、UNITE、INSDC和真菌生命之樹等真菌序列數(shù)據(jù)庫的不斷完善,再經(jīng)過實(shí)踐積累經(jīng)歷體驗(yàn),科學(xué)、正確地鑒定植物內(nèi)生真菌是完全能夠做到的。致謝:感謝中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室莊文穎教授提供很多原始文獻(xiàn)資料!感謝中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所李彥教授在植物采樣中給予的熱情幫助!以下為參考文獻(xiàn):[1]GuoLD,HuangGR,WangY,etal.MolecularidentificationofwhitemorphotypestrainsofendophyticfungifromPinustabulaeformis[J].Myco-logicalResearch,2003,107(6):680-688.[2]GazisR,MiadlikowskaJ,LutzoniF,etal.Culture-basedstudyofen-dophytesassociatedwithrubbertreesinPerurevealsanewclassofPezizo-mycotina:Xylonomycetes[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution,2020,65(1):294-304.[3]VilgalysR,HesterM.Rapidgeneticidentificationandmappingofenzy-maticallyamplifiedribosomalDNAfromseveralCryptococcusspecies[J].TheJournalofBacteriology,1990,172(8):4238-4246.[4]GardesM,BrunsTD.ITSprimerswithenhancedspecificityforbasidio-mycetes-applicationtoidentificationofmycorrhizaeandrusts[J].Molec-ularEcology,1993,2(2):113-118.[5]WhiteTJ,BrunsS,LeeS,etal.AmplificationanddirectsequencingoffungalribosomalRNAgenesforphylogenetics[C]//InnisMA,GelfandDH,SninskyJJ,WhiteTL.PCRprotocols:aguidetomethodsandapplica-tions.SanDiego:AcademicPress,1990:315-322.[6]LiuY,WhelenS,HallBD.Phylogeneticrelationshipsamongascomyce-tes:evidencefromanRNApolymeraseⅡsubunit[J].MolecularBiologyandEvolution,1999,16(12):1799-1808.[7]YangCS,KorfRP.Ascorhizoctoniagen.nov.andComplexipesemend.,twogeneraforanamorphsofspeciesassignedtoTricharina(Discomycetes)[J].Mycotaxon,1985,23:457-481.[8]YangCS,KorfRP.AmonographofthegenusTricharinaandofanewsegregategenus,Wilcoxina(Pezizales)[J].Mycotaxon,1985,24:467-531.[9]BarreraVA,RomeroAI.TricharinastriisporafromArgentinaandthefindingofitsanamorph,Ascorhizoctonia[J].Mycotaxon,2001,77:3184[10]ZhuangWY,KorfRP.SomenewspeciesandnewrecordsofDisco-mycetesinChina.Ⅲ[J].Mycotaxon,1989,35:297-312.[11]MooreRT.ThegeneraofRhizoctonia-likefungi:Ascorhizoctonia,Cer-atorhizagen.nov.,Epulorhizagen.nov.,Moniliopsis,andRhizoctonia[J].Mycotaxon,1987,29:91-99.[12]RobertsP.Rhizoctonia-formingfungi:ataxonomicguide[M].UK:KewPublishing,1999.[13]StrobelGA,TomsheckA,GearyB,etal.EndophytestrainNRRL50072producingvolatileorganicsisaspeciesofAscocoryne[J].Mycolo-gy,2018,1(3):187-194.[14]SchochCL,SeifertKA,HuhndorfS,etal.Nuclearribosomalinternaltranscribedspacer(ITS)regionasauniversalDNAbarcodemarkerforfun-gi[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA),2020,109(16):6241-6246.[15]HawksworthDL.MisidentificationsinfungalDNAsequencedata-banks[J].NewPhytologist,2004,161:13-15.[16]Holst-JensenA,VralstadT,SchumacherT.Onreliability[J].NewPhytologist,2004,161:11-13.[17]GuoLD.Moleculardiversityandidentificationofendophyticfungi[C]//GherbawyY,VoigtK.Molecularidentificationoffungi.BerlinHei-delberg:Springer-Verlag,2020:277-296.[18]YuanZL,RaoLB,ChenYC,etal.Frompattern