食品過敏原的檢測(cè)與分析

食品過敏原的檢測(cè)與分析食品過敏現(xiàn)已成為一個(gè)新興的公眾性健康問題，特別是在發(fā)達(dá)國(guó)家，調(diào)查顯示全世界范圍內(nèi)有1％~2％的成年人對(duì)食品過敏，而低于三歲的兒童中有8％以上對(duì)食品過敏。產(chǎn)生的臨床癥狀包括皮膚反應(yīng)(蕁麻疹、血管性水腫、濕疹)，呼吸癥狀(哮喘、鼻炎)，腸胃癥狀(嘔吐、腹瀉、腸胃痙攣)，系統(tǒng)反應(yīng)(心血管癥狀包括過敏性休克)等。在過去的幾十年中，食品過敏的發(fā)病率和流行情況日益增加，給臨床變態(tài)反應(yīng)學(xué)和食品工業(yè)造成了巨大的壓力。加上現(xiàn)在人們生活習(xí)慣的改變，飲食面的快速拓寬，特別是轉(zhuǎn)基因食品的大量涌現(xiàn)，過敏癥狀亦趨于多樣化、復(fù)雜化和嚴(yán)重化。因此，對(duì)食品過敏原的檢測(cè)與分析就是一個(gè)極其重要的問題。一般來說，食品過敏原為分子量介于10000~70000之間的蛋白或糖蛋白，占食品總蛋白的極小一部分，分別屬于不同的蛋白家族。但是微量的食品過敏原蛋白即可引起嚴(yán)重的過敏反成，本文對(duì)這一研究領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)的綜述性分析。1.利用人血清特異性lgE檢測(cè)食品過敏原過敏原與lgE結(jié)合是過敏原體現(xiàn)其生物活性的中心環(huán)節(jié)，因此食品過敏原檢測(cè)過程中特異性lgE的血清學(xué)檢測(cè)必不可少。對(duì)于能夠引起50％病人產(chǎn)生過敏反應(yīng)的主要食品過敏原必須測(cè)定特異性lgE與食品過敏原結(jié)合的能力，包括引發(fā)過敏反應(yīng)的頻率，熱穩(wěn)定性和水解穩(wěn)定性等。但是這種方法不能解決食品過敏原的交叉致敏問題，因?yàn)樗怯脝蝹€(gè)過敏病人的血清進(jìn)行檢自從lgE成功純化及抗lgE抗體的制備后，放射過敏原吸附實(shí)驗(yàn)(radioallergosorbenttestRAST)得以設(shè)計(jì)應(yīng)用。之后改進(jìn)的酶標(biāo)記過敏原吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinkedallergosorbentassays,EAST)及熒光和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)也均已建立。這些方法均是檢測(cè)特異性lgE與過敏原相互作用的免疫分析方法。特異性lgE抗體與食品過敏原的結(jié)合在固相載體表面進(jìn)行并被檢測(cè)，是體外食品過敏診斷的一種已標(biāo)準(zhǔn)化的方法，得到廣泛使用。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立了放射過敏原吸附抑制實(shí)驗(yàn)(radioallergosorbenttestRAST抑制實(shí)驗(yàn))和酶標(biāo)記過敏原吸附抑制實(shí)驗(yàn)技術(shù)(enzymelinkedallergosorbentassays,EAST抑制實(shí)驗(yàn))。在體外過敏原檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，這些方法是目前國(guó)際上變態(tài)反應(yīng)臨床及科研人員使用最廣泛、最靈敏的驗(yàn)操作帶來的誤差，保證了它的靈敏性和準(zhǔn)確性，同時(shí)解決了不同食品過敏原的交叉致敏問題。因此在國(guó)際上不同實(shí)驗(yàn)室之間，RAST抑制實(shí)驗(yàn)技術(shù)和統(tǒng)計(jì)分析方法按統(tǒng)一的程序進(jìn)行，每年還有定期的全球質(zhì)量控制檢測(cè)以保證儀器正常運(yùn)行和結(jié)果可靠。目前，在國(guó)外大醫(yī)院、主要過敏原生產(chǎn)企業(yè)基本都使用法瑪西亞公司UniCAP系統(tǒng)進(jìn)行RAST抑制實(shí)驗(yàn)。此外，RAST抑制實(shí)驗(yàn)還是過敏原生產(chǎn)廠商比較每一批過敏原制劑和內(nèi)部參考品差異的主要方法。RAST和EAST抑制實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被用來檢測(cè)和分析一系列食品的致敏性，如生海鮮和比薩餅中的鱈魚過敏原；含有花生的食品和花生油等相關(guān)產(chǎn)品的致敏性；大豆相關(guān)食品的致敏性；榛實(shí)過敏原的熱穩(wěn)定性和水解穩(wěn)定性研究；堅(jiān)果類食品的交叉致敏作用等。RAST和EAST抑制實(shí)驗(yàn)的一個(gè)主要不足是對(duì)人血清的依賴性，血清是很難保證一致的，因此這兩種方法也難以標(biāo)準(zhǔn)化。盡管它們可以很好的檢測(cè)食品過敏原，但是人lgE抗體特異性的不確定性大大限制了這些方法在更寬領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，商業(yè)化的食品過敏原固相載體與lgE的結(jié)合能力也不盡相同。所有這些都限制了RAST和EAST抑制實(shí)驗(yàn)在食品過敏原定量檢測(cè)中的應(yīng)用。總體上來說，RAST和EAST抑制實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)各種形式的食品過敏原蛋白 (蛋白粗提物，純化的過敏原樣品，不同物種、食品中過敏原)與lgE結(jié)合能力的較為理想1．2IEF－PAGE和SDS－PAGE免疫印跡實(shí)驗(yàn)通過等電聚焦(IEF)和SDS－PAGE電泳(雙向電泳也包括在內(nèi))結(jié)合免疫印跡分析可以進(jìn)行單個(gè)食品過敏原的分離。SDS－PAGE免疫印跡目前可以用于幾乎所有的食品過敏原的分析。雙向電泳常用于檢測(cè)分子量相近但等電點(diǎn)、氨基酸序列不同的同源性蛋白分子。與RAST和EAST類似，免疫印跡方法同樣可以通過lgE抑制實(shí)驗(yàn)來消除不同來源的不同食品過敏原之間的交叉反應(yīng)。2用單克隆或多克隆抗體檢測(cè)食品過敏原為了克服用人血清lgE抗體檢測(cè)食品過敏原的不足，依賴于兔、鼠、綿羊、山羊、雞等的動(dòng)物抗血清免疫分析方法逐漸發(fā)展起來。這些抗體檢測(cè)激發(fā)免疫作用抗原的效果要比過敏原好。2．1雙免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(Ouchterlony)這是一種比較兩種或兩種以上食品過敏原的定性檢測(cè)分析方法。將抗體和各種不同的樣品雙免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)可以區(qū)分一致的、不一致的和部分一致的蛋白樣品。MALMHEDENYMAN等利用雙免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析了意大利面食和蕎麥?zhǔn)称分械柠滬煹鞍住Ｔ摲椒ǖ牟蛔闶遣荒苓M(jìn)行定量分析，靈敏度較低，而且比較費(fèi)時(shí)(24~48h)。2．2點(diǎn)免疫印跡實(shí)驗(yàn)最近報(bào)道了點(diǎn)免疫印跡實(shí)驗(yàn)在各種食品中檢測(cè)花生過敏原中的應(yīng)用。將樣品滴在預(yù)先用花生蛋白抗體包埋的一張聚酯底物上，再用二抗進(jìn)行免疫檢測(cè)即可檢測(cè)到已經(jīng)結(jié)合的花生蛋白。這種方法靈敏度很高而且使用成本較低。2．3火箭免疫電泳實(shí)驗(yàn)(RIE)該分析方法是通過含有抗體的凝膠進(jìn)行檢測(cè)分析的。樣品中的蛋白根據(jù)各自的電泳移動(dòng)速動(dòng)，直到按照抗體／抗原的比例常數(shù)在凝膠上形成“火箭”狀的沉淀?；鸺隣畛恋韰^(qū)的顏色的深淺與樣品中蛋白的豐度直接相關(guān)。所形成的沉淀既可以用考馬斯亮藍(lán)染色也可以用免疫染色(后者的靈敏度更高)。RIE應(yīng)用于食品過敏原檢測(cè)的報(bào)道較為少見。MALMHEDENYMAN等用RIE檢測(cè)了各種食品中雞蛋、牛奶、榛實(shí)和花生蛋白的存在，但是沒有指出數(shù)據(jù)的回收率和重現(xiàn)性。RIE的不足就是實(shí)際操作過程中制膠和染色的操作復(fù)雜。2．4酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)ELISA是一種酶免疫方法，20世紀(jì)90年代末期ELISA技術(shù)發(fā)展迅速，加以全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀的應(yīng)用，使ELISA的特異性和靈敏度有了很大的提高，在食品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用大大擴(kuò)展。ELISA的特點(diǎn)是抗原或抗體的固相化和酶標(biāo)記，在目前最常用的ELISA中，抗體要結(jié)合在固相載體的表面與樣品蛋白(抗原)自由反應(yīng)。抗體和抗原反應(yīng)后用另外一種用酶標(biāo)記的抗體(二抗)來檢測(cè)已經(jīng)反應(yīng)結(jié)合在固相載體表面的樣品蛋白(抗原)。結(jié)合在固相載體表面的抗體一定時(shí)，與之結(jié)合的樣品蛋白(抗原)越多，酶標(biāo)記的抗體的顏色反應(yīng)就越強(qiáng)，同時(shí)血清抗體的濃度越高，ELISA顯色也越強(qiáng)。為了能夠檢測(cè)痕量的食品過敏原ELISA中使用了生物素標(biāo)記的二抗和含有過氧化物酶的鏈霉親和素。在食品安全方面ELISA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于獸藥殘留、農(nóng)藥殘留、疫情、有害微生物、動(dòng)植物毒素等的快速檢測(cè)分析，并取得了較好的效果。隨著人們對(duì)食品過敏認(rèn)識(shí)的深入和重視程度的加強(qiáng)，現(xiàn)在發(fā)展了很多種ELISA方法用于食品過敏原總蛋白提取物和特殊食品過敏原的檢測(cè)和定量分析。ELISA已經(jīng)成為一種系列化、微量化、商品化的食品安全快速檢測(cè)方3PCR分析食品過敏原檢測(cè)的一個(gè)新靶標(biāo)就是特殊食品蛋白的cDNA。DNA分子可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增，在PCR過程中DNA分子的引物也得到了擴(kuò)增。產(chǎn)物即可利用分子量的大小在瓊脂糖電泳上進(jìn)行分離。一般來說通過引物的選擇可以使具有一定同源性的DNA分子之間的交叉反免假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。PCR擴(kuò)增技術(shù)一般用來對(duì)各種食品中經(jīng)基因修飾的成份(如轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米)的檢測(cè)和定量分析。而直到現(xiàn)在，只有兩種PCR方法專門針對(duì)食品過敏原(榛實(shí)和小麥)的檢測(cè)(表1)。兩種方法均具有很高的靈敏度，都可以達(dá)到0．001％。3．1研究食品的DNA性質(zhì)(質(zhì)量)盡管麥片中麥膠蛋白的檢測(cè)限度低于0．2mg／100g，但是用小麥PCR系統(tǒng)分析燕麥糠制造的酸乳酪布丁樣品此，與小麥PCR檢測(cè)方法的高靈敏度相比，對(duì)這些樣品用ELISA檢測(cè)試劑盒更為合適。HOLZHAUSER等[11]對(duì)烤榛實(shí)(140℃，30min)中低豐度主要榛實(shí)過敏原Cora1(0．001％)的DNA進(jìn)行了擴(kuò)增(與巧克力和其他不同的食品中榛實(shí)蛋白的含量一致)。而且不同的食品類型也大大影響了過敏原DNA的定量檢測(cè)限度。也有人應(yīng)用PCR技術(shù)研究了食品處理過程相關(guān)參數(shù)對(duì)面包類食物中轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米成分檢測(cè)的影響[13]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在研究的食品(面包和蛋糕)中含量低于0．5％轉(zhuǎn)基因玉米的DNA是檢測(cè)不到的，而經(jīng)過各個(gè)加工步驟(包括200℃烤30min)后得到的白面包中加入的0．3％轉(zhuǎn)基因大豆的DNA是可以檢測(cè)的。這就說明在用PCR技術(shù)檢測(cè)過敏原DNA時(shí)一定要考慮食品處理過程中過敏原DNA的降解。3．2與ELISA的對(duì)比ELISA可以檢測(cè)食品樣品中已知來源(包含過敏原)的蛋白，而PCR可以在相關(guān)蛋白不存在的情況下檢測(cè)其DNA的存在。因此，PCR技術(shù)增加了食品中存在過敏原假陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果的機(jī)率。PCR方法的優(yōu)點(diǎn)是比較快，如果要研究已知序列的DNA，這個(gè)分析過程只需要7~10d。對(duì)于一個(gè)已經(jīng)純化的過敏原，ELISA分析要用一個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間，此外，制備其特異性的抗體要再加一個(gè)月。PCR技術(shù)是以簡(jiǎn)單、確定的DNA序列為基礎(chǔ)的，而ELISA分析卻要依賴于質(zhì)量穩(wěn)定的動(dòng)物抗體。將來重組抗體將有助于抗血清的標(biāo)準(zhǔn)化。加工食品中DNA和蛋白的穩(wěn)定性都是要考慮的重要因素?？傊琍CR技術(shù)適合于復(fù)雜食品中過敏原的定量分析，在這方面應(yīng)該得到大力推廣。4組胺釋放實(shí)驗(yàn)(HRT)組胺釋放實(shí)驗(yàn)(histaminereleasingtest，HRT)主要是通過食品過敏原激發(fā)致敏的靶細(xì)胞，引起細(xì)胞釋放組胺，組胺含量可應(yīng)用熒光測(cè)定法、放射免疫法定的一類方法。通常用抗IgE抗體作陽(yáng)性參照，以樣品介質(zhì)(如PBS)為陰性參照，以排除實(shí)驗(yàn)過程中組胺的非特異性釋放。此外，某些待測(cè)過敏原或提取物本身含有組胺，并且待檢過敏細(xì)胞對(duì)照。為了排除生物胺如尸胺、腐胺對(duì)熒光法測(cè)定組胺的干擾，有報(bào)道利用玻璃纖維包被的微量滴定板(glass－fibrecoatedmicrotiterplate)來分離組胺與干擾成分。肝素化洗滌血(heparinizedwashedblood)不用進(jìn)一步分離便可測(cè)定，也可直接應(yīng)用全血或密度富積的Bas進(jìn)行測(cè)定。該改良方法只需25ul全血，可實(shí)現(xiàn)微量化操作。NORGAARD等將HRT用于雞蛋和牛奶過敏原的檢測(cè)和診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)該方法具有較好的靈敏度，結(jié)果的重現(xiàn)性很好，但是食品的狀態(tài)(是否新鮮)對(duì)其影響較為顯著。在鱈魚過敏原的檢測(cè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與雙盲對(duì)照試驗(yàn)相比HRT具有較高的特異性和較低的靈敏度，但新鮮鱈魚的過敏原提取物可以顯著增強(qiáng)HRT檢測(cè)的靈敏度。此外，HRT還成功的用于花生、榛子過敏原的檢測(cè)及致敏作用機(jī)理的研究。5過敏原指紋圖譜快速檢測(cè)方法中藥指紋圖譜是在制定中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的過程中針對(duì)中藥中成分的復(fù)雜性以及缺乏用以鑒定成分所需的化學(xué)對(duì)照品這一癥結(jié)而產(chǎn)生的一種方法，是在中藥化學(xué)成分色譜指紋圖譜的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。指紋圖譜最早的概念來源于19世紀(jì)末20世紀(jì)初的犯罪學(xué)和法醫(yī)學(xué),是最新科技成果與最古老的醫(yī)學(xué)科學(xué)傳統(tǒng)相結(jié)合的結(jié)果。作為一種綜合的、宏觀的和可量化的鑒別手的特點(diǎn)，其在中醫(yī)藥界的應(yīng)用受到全世界范圍內(nèi)的認(rèn)可。鑒于指紋圖譜的實(shí)用性和科學(xué)性，食品與中藥諸多方面的相似性，吳海強(qiáng)等首次提出將指原的快速檢測(cè)、分食品過敏原總蛋白2－DE指紋圖譜在食品過敏原快速檢測(cè)中應(yīng)用的可行性，肯定了該方法在不同檢測(cè)儀器和試驗(yàn)耗材之間良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了以2－DE指紋圖譜為基礎(chǔ)進(jìn)行