藥品檢驗用菌種的傳代和保藏

藥品檢驗用菌種的傳代和保藏第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日菌種的定義及其與各應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)系菌種泛指從自然界獲取的各種微生物的不同的種。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究菌種主要考慮其致病機理工業(yè)生產(chǎn)研究菌種主要考慮其發(fā)酵機理藥品微生物檢驗主要考慮其標準性

第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日標準菌種的概念及其管理標準菌種是指由國家授權(quán)機構(gòu)制備的具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性并用妥善方法保藏的菌種。我國的標準菌種統(tǒng)一由中國菌種保藏管理委員會（CCCCM）管理，涉及藥品微生物檢驗的菌種由醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）提供第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日標準菌種的保藏形式我國提供的標準菌種通常是以凍干粉的形式包裝于熔封的厚玻璃容器中。在這種容器中，微生物通常與賦形劑共存，由于缺乏生長必須的環(huán)境條件，一般呈休眠狀態(tài)。第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日純培養(yǎng)所謂微生物的純培養(yǎng)是指在一個微生物的菌落形成單位中，所有的微生物細胞或孢子都屬于生物學(xué)的同一個種。嚴格地說，純培養(yǎng)是在培養(yǎng)基上由一個細胞或孢子分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。在該細胞或孢子的生長過程種，不受其他微生物的侵犯，不會在培養(yǎng)物中產(chǎn)生另外微生物種的后代，在整個生長過程中不發(fā)生變異或死亡。

第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日獲取純培養(yǎng)的工作環(huán)境1、潔凈工作室：環(huán)境潔凈度10000級下的局部100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)，全過程必須無菌操作，防止微生物污染。2、無菌隔離艙第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日獲取純培養(yǎng)的接種工具1、接種環(huán)2、接種針3、接種鏟4、接種鉤5、其他玻璃器械第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日獲取純培養(yǎng)的其他器具1、玻璃器皿：如各種規(guī)格培養(yǎng)皿。2、微生物實驗室常用的設(shè)備，如高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日獲取純培養(yǎng)的主要技術(shù)－移植（又稱接種）微生物的移植（或稱接種）是指將微生物接種在培養(yǎng)基上的操作。第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日移植（又稱接種）的兩種方式－劃線和穿刺1、劃線法是指用接種工具將微生物細胞移植在固體培養(yǎng)基斜面或平板上的一種方法。2、穿刺法是指用接種工具將微生物細胞移植到固體或半固體培養(yǎng)基內(nèi)的一種方法。

第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日影響集菌培養(yǎng)效果的若干因素溫度滲透壓氧氣光pH值和氧化還原電位培養(yǎng)基抗生素第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日驗證純培養(yǎng)的主要依據(jù)1、用顯微鏡觀察時，全部的生物個體是相似的，如果是細菌，對革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)當(dāng)是一致的。2、將培養(yǎng)物制成懸液，重新傾注平板，或平板劃線培養(yǎng)后，所形成的全部菌落的形態(tài)應(yīng)該是相似的。如果是細菌，將重新形成的菌落各作穿刺培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征應(yīng)當(dāng)是一致的。3、從重新分離的各菌落作生理特征觀測時，如對氮源的利用，對糖類的發(fā)酵或同化以及其他生理生化的測定，應(yīng)呈現(xiàn)出一致性。

第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日定期移植保藏法一般步驟為：將菌種接種在所要求的培養(yǎng)基上，置最適溫度下集菌培養(yǎng)。得到健壯的菌體（如有性孢子、無性孢子或細胞等）后，放于溫度較低、干燥處保藏，并且每隔一定時間重新移植培養(yǎng)一次。

第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日定期移植保藏法1、細菌置4～6℃保藏，芽孢桿菌每3～6個月移植一次，其他細菌每月移植一次。

2、放線菌于4～6℃保藏，每3個月移植一次。

3、酵母菌于4～6℃保藏，每4～6個月移植一次。

4、絲狀真菌于4～6℃保藏，每3個月移植一次。

5、擔(dān)子菌于4～6℃保藏，每3個月移植一次。6、保藏的濕度通常在50％～70％為宜。

第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日定期移植保藏法1、需定期檢查2、移植進行時，應(yīng)仔細核對3、集菌培養(yǎng)完成后，應(yīng)比較培養(yǎng)特征4、應(yīng)注意觀察各代之間的變化第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日瓊脂斜面低溫保藏法1、菌種的典型菌落接種至斜面，規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，充分生長，硅膠塞換成無菌橡膠塞。4～6℃冰箱保藏a:1～3個月移植一次，繼續(xù)保藏。b:用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，可保藏半年至一年。第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日瓊脂斜面低溫保藏法適用細菌、霉菌、酵母菌及放線菌保藏優(yōu)點：簡便、大多數(shù)微生物適用缺點：保藏期短；傳代次數(shù)多；容易發(fā)生變異及污染。生孢梭菌用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、乙型溶血性鏈球菌及肺炎球菌用血肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日液體石蠟保藏法一般步驟為：準備液體石蠟并滅菌去水備用。獲得需要保藏菌種的純培養(yǎng)，將液體石蠟注入培養(yǎng)容器中，并完全覆蓋培養(yǎng)基。液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基上端0.5～1cm為宜

4～6℃冰箱保藏第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日液體石蠟保藏法確保保藏環(huán)境的干燥，避免長霉。使用此法保藏的菌種時應(yīng)特別注意防止微生物外濺污染。該法對酵母菌的保藏最為有效，對大多數(shù)細菌保藏效果一般。第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日甘油冷凍保藏法將保藏菌種接種瓊脂斜面上，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間，用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使菌種充分擴散到無菌水中，調(diào)證菌液濃度，向已制備好的菌懸液加入等體積的20％無菌甘油，輕輕振試管管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小管。甘油冷凍管最好在-30℃貯存。第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日沙管保藏法制備沙管培養(yǎng)接種制備菌懸液混菌干燥保藏適合保藏芽孢桿菌、梭菌、放線菌和一些絲狀真菌。

第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日土壤保藏法用土壤替代沙管保藏法中的河沙，其余操作與沙管保藏法相同適合保藏土壤細菌、放線菌和絲狀真菌，時間為2～6年。

第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日硅膠保藏法用硅膠替代沙管保藏法中的河沙，其余操作與沙管保藏法相同適合保藏酵母菌和某些絲狀真菌

第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日濾紙保藏法保藏微生物細胞或孢子的載體為濾紙。對細菌、酵母菌、絲狀真菌等都有一定的效果，有些菌種最長可達17年。第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日明膠片保藏法制備無菌營養(yǎng)明膠制備無菌石蠟濾紙微生物培養(yǎng)并制成濃厚的懸液在懸液中加入營養(yǎng)明膠將含微生物細胞或孢子的營養(yǎng)明膠滴于石蠟濾紙表面干燥將形成的明膠片密封保藏第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日麩皮保藏法我國歷史悠久的微生物保藏法適于保藏根霉、曲霉、青霉、紅曲霉等屬和赤霉菌

第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日梭氏真空干燥保藏法在小試管中放置菌懸液小試管在大試管中放置大試管在真空狀態(tài)下干燥密封大試管第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日液體直接干燥保藏法需要加入保護劑干燥之前不需凍結(jié)在干燥過程中為增大蒸發(fā)面積，可加入多孔材料干燥后的容器應(yīng)熔封第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日蒸餾水保藏法最為簡便的微生物保藏法微生物細胞或孢子保藏在蒸餾水中保藏的容器應(yīng)密封適于保藏棒狀桿菌、土壤桿菌和假單孢菌等

第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日液氮冰箱超低溫保藏法需專用設(shè)備－液氮超低溫冰箱菌懸液密封于安瓿管內(nèi)，控速凍結(jié)國外已普遍采用保藏時間長第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日凍結(jié)真空干燥保藏法歷史悠久，又稱凍干法不產(chǎn)生孢子只產(chǎn)生菌絲體的絲狀真菌不宜采用該法適用面廣保藏時間可達10年以上多為菌種保藏機構(gòu)采用第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日凍結(jié)真空干燥保藏法密封性好，可避免保藏期間的污染保藏容器體積小，方便攜帶和貯藏保藏時間更長，變異概率更低第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日普通微生物實驗室適用的保藏技術(shù)瓊脂斜面低溫保藏法液體石蠟保藏法低溫冷凍保藏法甘油冷凍保藏法第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日瓊脂斜面低溫保藏法細菌置4～6℃保藏，芽孢桿菌每3～6個月移植一次，其他細菌每月移植一次。

放線菌于4～6℃保藏，每3個月移植一次。

酵母菌于4～6℃保藏，每4～6個月移植一次。

絲狀真菌于4～6℃保藏，每4個月移植一次。

擔(dān)子菌于4～6℃保藏，每3個月移植一次。保藏的濕度通常在50％～70％為宜。

第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日菌種保藏的一般規(guī)定1、菌種“代”的確定：2005版藥典規(guī)定，以干燥菌種管為第“0”代，由此得到的第一批子代為第一代，以此類推。2、菌種傳代次數(shù)規(guī)定：2005版藥典規(guī)定不超過5代。3、菌種應(yīng)專人保藏、專柜貯藏，認真做好登記，統(tǒng)一編號，按期傳代，并做好有關(guān)檢驗記錄。4、保存菌種傳代或凍干均應(yīng)填寫專用記錄，菌種管上應(yīng)有標簽，表明菌種編號、代次、批號、日期。5、過期菌種應(yīng)及時處理、登記，經(jīng)121℃30分鐘滅菌消毒。第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日實驗室菌種傳代操作步驟1、接種前用1：1000新潔爾滅擦拭工作臺面，然后開紫外燈消毒30分鐘。2、自冰箱取出保存工作用菌種，室溫放置20分鐘；溫度平衡后才能傳代。3、實驗人員進入緩沖間，換鞋、穿無菌衣、戴口罩，用1：1000新潔爾滅溶液消毒雙手，并將培養(yǎng)基及菌種移入陽性菌接種室。4、點燃酒精燈，將菌種管塞子，通過火焰轉(zhuǎn)動使稍稍松動，以免接種時粘著打不開。5、接種操作：左手拿住菌種管，將管口靠近火焰旁，右手拿接種棒，將白金耳燒紅約30秒，桿部通過火焰滅菌。挑取少量菌苔；另取，照上述方法在火焰旁打開塞子，將白金耳伸入管內(nèi)斜面培養(yǎng)基的底部，從下到上將白金耳輕貼斜面培養(yǎng)基的表面作曲折移動。5、接種后，將斜面置規(guī)定溫度、時間培養(yǎng)。取出觀察，菌種生長良好，換橡皮塞，貼上標簽，放入冰箱保存。6、細菌一個月傳代一次，枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉可三個月傳代一次。第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日菌種管理1、標準菌種必須從認可的菌種收集途經(jīng)獲得；實驗室必須建立和保存所有菌種的收集、貯藏、保存、確認試驗的記錄。2、實驗室應(yīng)有文件管理標準菌種（從原始菌種到工作用菌種）。該程序應(yīng)包括：a:標準菌種必須定期傳代，并做確認試驗，包括實驗室在所需要關(guān)鍵診斷指標，實驗室必須記錄并保存。b：每一子菌種都應(yīng)以適當(dāng)標簽、標記來表示名稱、標準號、接種日期和傳代日期。C:每一子菌種都應(yīng)以標記從原始菌種傳代到工作用菌種的代數(shù)；記錄菌種生長的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；菌種生存條件等。第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日過期菌種處理過期菌種應(yīng)及時清理、登記，并經(jīng)121℃、30分鐘高壓消毒滅菌。第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日例1：金黃色葡萄球菌傳代保藏技術(shù)1、購置金黃色葡萄球菌（如我所提供的菌種為第二代菌種），假定購置日期為5月21日。2、準備10支營養(yǎng)瓊脂斜面，其中2支用于保藏，其余8支用于當(dāng)月實驗。3、于5月22日打開菌種管，接種菌種至上述10支斜面，35℃培養(yǎng)16～18小時。4、將10支第三代菌種管做好標簽，置適宜溫度保藏。5、5月22日至6月22日，可以使用上述第三代菌種管。6、至6月22日，重復(fù)步驟2，得第四代菌種管。7、至8月22日前，重新購置原種管。第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日例2：黑曲霉的傳代技術(shù)1、制備孢子懸液：取滅菌水或生理鹽水3～5ml，分2～3次小心滴加至菌種管內(nèi)（試管斜面），反復(fù)振搖。傾取孢子懸液置另一滅菌試管。2、涂布接種：用滅菌滴管吸取懸液滴加至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面，每管滴加2～3滴，轉(zhuǎn)動試管，使懸液與斜面表面充分接觸第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日菌種確認試驗包括以下幾個方面：1、菌落生長情況：目測2、染色鏡檢：3、生化試驗；(1)糖醇代謝試驗（2）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗（3）碳源和氮源利用試驗（4）酶類試驗（5）其他試驗第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日短小芽孢桿菌確認該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過顯微鑒別，為不呈鏈狀排列的桿菌，革蘭氏染色為陽性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔光滑，薄，閃光，蔓延，不粘著，常常是淺黃色。

3、生化試驗可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原，結(jié)果為明膠緩慢液化，淀粉水解陰性，硝酸鹽還原陰性。第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日枯草芽孢桿菌確認該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過顯微鑒別，為呈鏈狀排列的桿菌，不形成莢膜，革蘭氏染色為陽性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長豐厚，粗糙，不透明，不閃光，蠟質(zhì)，蔓延，奶油色至微褐色。3、生化試驗可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原，結(jié)果明膠呈漏斗形至層狀液化，淀粉水解陽性，硝酸鹽還原陽性。第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日大腸埃希菌確認該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過顯微鑒別，為成對和呈短鏈排列的近球形的桿菌，一般不形成莢膜，革蘭氏染色為陰性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔通常白色，有時帶黃白色，濕潤，閃光，蔓延生長。3、生化試驗可選做明膠穿刺和靛基質(zhì)試驗、甲基紅試驗、V.P.試驗和檸檬酸鹽利用試驗，結(jié)果不液化明膠，靛基質(zhì)試驗和甲基紅試驗陽性，V.P.和檸檬酸鹽利用試驗陰性。第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日大腸埃希菌該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，有一整套完整的鑒定手段，也可參考該方法用于判斷所保藏的菌種有無發(fā)生變異。該鑒定方法主要內(nèi)容即為經(jīng)典的IMViC試驗，結(jié)果為++--。第四十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日銅綠假單孢菌確認該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過顯微鑒別，為單個，成對或呈短鏈排列的桿菌，有運動性，革蘭氏染色為陰性。2、營養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長旺盛，薄，白色，閃光，培養(yǎng)基變?yōu)榫G色至暗褐色或黑色，發(fā)熒光。3、生化試驗可選做明膠穿刺、吲哚和硝酸鹽還原試驗，結(jié)果迅速液化明膠，液體呈淺黃綠色或淺藍綠色，吲哚試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性。第四十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日銅綠假單孢菌該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，可利用氧化酶試驗和綠膿菌素試驗迅速判斷所保藏的菌種有無發(fā)生變異。第四十七頁，共五十二頁，2022