花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)第一頁，共四十一頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)花粉和花藥培養(yǎng)應用第二頁，共四十一頁，2022年，8月28日(1)掌握花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的區(qū)別(2)了解花藥最佳接種時期(3)掌握花藥培養(yǎng)的大致過程(4)掌握花粉發(fā)育的四種途徑(5)掌握花粉培養(yǎng)的大致過程教學目的與要求第三頁，共四十一頁，2022年，8月28日胚珠第四頁，共四十一頁，2022年，8月28日第五頁，共四十一頁，2022年，8月28日花的結(jié)構(gòu)第六頁，共四十一頁，2022年，8月28日第七頁，共四十一頁，2022年，8月28日花藥是花的雄性器官，花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)；花粉是單倍體細胞，花粉培養(yǎng)與單細胞培養(yǎng)相似花藥和花粉都可以在培養(yǎng)過程中誘導單倍體細胞系和單倍體植株。單倍體植株經(jīng)過染色體加倍就成為純合二倍體植株，這樣可縮短育種周期，獲得純系。花培已成為植物育種的一種重要手段。

一、概述第八頁，共四十一頁，2022年，8月28日植物的花粉是花粉母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的，其染色體數(shù)目只有體細胞的一半，叫做單倍體細胞(haploidcell)?；ǚ酆突ㄋ幍呐囵B(yǎng)(pollenandantherculture)是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機能，不經(jīng)受精而發(fā)生細胞分裂，由單個花粉粒發(fā)育成完整植株的技術(shù)。用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個完整的植株，叫做單倍體植物(haplobiont)。一、概述第九頁，共四十一頁，2022年，8月28日花藥培養(yǎng)是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進而分化成植株的技術(shù)。第十頁，共四十一頁，2022年，8月28日

花粉和花藥培養(yǎng)的研究意義誘導形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期有利于篩選隱性突變體，提高選擇效率獲得無病毒個體有利于隱性基因控制性狀的選擇快速獲得自交系的超雄株單倍體植株育種第十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日

花藥培養(yǎng)簡史1964年：印度學者古哈(Guha)和馬斯瓦瑞（Maheswari）將南洋金花花藥培養(yǎng)發(fā)育成胚1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花藥培養(yǎng)獲得煙草植株1973年：我國首次報道了小麥花藥培養(yǎng)獲得再生植株目前：許多農(nóng)作物及經(jīng)濟植物通過花粉培養(yǎng)都能誘導成植株第十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日花藥培養(yǎng)的主要目的，是培育花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料的來源。利用雜種花藥離體培養(yǎng)獲得的再生植株，由不同基因型的配子發(fā)育而來，具有豐富的變異類型，選擇出有利的變異類型，經(jīng)過經(jīng)濟性狀鑒定后，選出優(yōu)良者直接用于生產(chǎn)或配制雜交組合，獲得優(yōu)良雜交種子。構(gòu)建永久性分離群體－雙單倍體系（Doubledhaploid)，用于基因定位。雙單倍體：是指單倍體細胞（花粉或卵細胞）經(jīng)過人工或自發(fā)加倍后得到雙單倍體細胞，細胞經(jīng)誘導分化可發(fā)育為單雙倍體植株。

花藥培養(yǎng)與單倍體育種第十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日大大縮短育種周期通過多次自交或近交獲得的幾乎是同質(zhì)結(jié)合的品系單倍體植株再通過某種手段使染色體組加倍（如秋水仙素處理）從而使植物恢復正常染色體數(shù)第十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日確定取材時間選擇大致處于所需要時期的花蕾。由于花粉發(fā)育時期和植株的某些外部形態(tài)特征之間的大致相關(guān)性，因此利用這些外部標志，選擇符合條件的花蕾，經(jīng)鏡檢確定花粉發(fā)育的準確時期。在水稻中，以單核靠邊期的花粉對誘導單倍體植株較為適宜，在外部形態(tài)上可根據(jù)葉枕距為5～15cm，穎片（禾本科植物小穗基部，由苞片轉(zhuǎn)變而成）淡黃綠色、雄蕊長度接近穎片長度的1/2這些條件來判斷。二、花藥培養(yǎng)技術(shù)第十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日水稻花藥培養(yǎng)旗葉鞘用70％酒精擦洗一遍剝?nèi)テ烊~鞘，取出稻穗左手持穗，右手用鑷子取出花藥，無菌培養(yǎng)皿中70％酒精，洗2遍用接種環(huán)接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，花藥變黑褐色，20天花藥裂開，長出淡黃色的花粉愈傷組織，先形成芽，后長出根，形成幼苗。第十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日選取主穗（一級側(cè)枝）的花蕾，因為一級側(cè)枝的花蕾發(fā)育良好，數(shù)量大，發(fā)育同步。操作過程中不應使花藥受到損傷，若受損傷，則應淘汰，因為損傷常常會刺激花粉壁形成二倍體的愈傷組織。注意事項第十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日光照(12~18h，5,000~10,000lx，28℃)黑暗(12-16h，22℃)周期交替進行?；ㄋ幣囵B(yǎng)的條件第十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日①花粉發(fā)育時期是影響培養(yǎng)效果的重要因素在誘導花粉進行雄性發(fā)育(指小孢子沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株)過程中，不同物種花粉最適的發(fā)育時期不同，對多數(shù)植物來說，單核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織。如南洋金花、煙草和芍藥中的最適時期是第一次有絲分裂時期或稍前后，禾本科植物在單核早期(大麥)或單核中期(玉米、小麥)反應最好，番茄在減數(shù)分裂中期時更適宜。1、影響花藥誘導頻率的因素第十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日②花藥供體植株的生長條件對花藥培養(yǎng)反應的影響很大例如：水稻、小麥、大麥等禾本科植物，主莖穗比分蘗穗花藥愈傷組織的誘導率明顯地提高，同步化程度高。第二十頁，共四十一頁，2022年，8月28日③培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)中影響花粉啟動和再分化的重要條件我國科學工作者對水稻、小麥的花藥培養(yǎng)基做了改進，研制出N6培養(yǎng)基。在N6培養(yǎng)基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。N6培養(yǎng)基的特點是銨離子濃度較低。隨后，進一步降低銨鹽和硝酸鹽濃度，同時附加生物素，研制出C17和W14培養(yǎng)基，它們可以大幅度提高小麥的花藥出愈率。以馬鈴薯提取液為基本成分的馬鈴薯培養(yǎng)液，現(xiàn)在被廣泛地應用于小麥花藥培養(yǎng)，效果良好。

第二十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基中的植物生長物質(zhì)的種類會影響花粉發(fā)育的途徑一般在禾本科植物中，常用1～5mg/L2,4-D或NAA誘導花粉愈傷組織形成，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移至降低或去除生長素或補加細胞分裂素類物質(zhì)的分化培養(yǎng)基上，以誘導器官分化和再生植株形成。第二十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基中糖的種類對花粉胚的誘導和分化有顯著影響朱至清等(1990)報道在過濾滅菌的條件下，若以0.21mg/L葡萄糖取代液體培養(yǎng)基中同等濃度的蔗糖，小麥花粉胚的誘導頻率可增加2～10倍。一般說來，高蔗糖濃度可以抑制體細胞的生長而對花粉的生長無妨礙。最適蔗糖濃度：煙草的為3％水稻為3％～6％玉米則為12％～15％第二十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日在培養(yǎng)基中加入活性炭能促進花藥培養(yǎng)水稻的柱頭-花藥第二十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日以1～5℃預低溫處理小麥幼穗，能提高花粉愈傷組織的產(chǎn)量。例如，在4℃下冷凍石刁柏花蕾，預處理4天、8天和12天，愈傷組織誘導率比室溫對照分別提高2.4倍、1.9和1.5倍。各種植物要求預處理的溫度和時間不同。2、低溫預處理可以提高花粉胚的誘導頻率第二十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日小麥要求先高溫培養(yǎng)64天之后，再轉(zhuǎn)入28～30℃下培養(yǎng)。一直高溫培養(yǎng)效果并不好。較高的溫度雖能誘導較高頻率的花粉愈傷組織，但愈傷組織分化白化苗的頻率也高?？刂婆囵B(yǎng)溫度仍是減少白化苗的一個有效措施。培養(yǎng)溫度是影響花藥反應的一個重要因素第二十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日3、花藥培養(yǎng)過程花藥材料的選取關(guān)鍵選取處于合適發(fā)育期的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動花粉發(fā)育。實踐表明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有可能誘導離體孤雄發(fā)育。大多數(shù)園藝植物的花藥培養(yǎng)，成功率最高的時期為單核期，或單核中晚期。第二十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日黃心烏花藥培養(yǎng)甜椒花藥培養(yǎng)第二十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日草莓花藥愈傷組織再生植株花藥植株第二十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日杜蘭小麥的花藥培養(yǎng)A花藥在BAD-3誘導下，3周后形成胚狀體和愈傷組織B另一個花藥在BAC-1培養(yǎng)基中已愈傷組織中長出葉片C

更多的花藥在BAD-3培養(yǎng)基上誘導出愈傷組織與子葉D

從BAC-1轉(zhuǎn)移到BAD-1分化培養(yǎng)基中形成的愈傷組織E

在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-6周，愈傷組織開始分化根和綠色的新芽F

在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-8周，可形成大量的根和幼莖G在MS再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周后，可由最初的花藥形成小植株H由花藥形成的健壯小植株I

花藥形成的植株在同樣的MS再生培養(yǎng)基中生長，可因培養(yǎng)條件改變而形成不正常的植株第三十頁，共四十一頁，2022年，8月28日花粉植株染色體可自發(fā)加倍人工措施染色體加倍傳統(tǒng)方法是用秋水仙素處理。較大濃度的秋水仙素溶液處理單倍體植株，時間為24～96h。浸泡試管苗方法處理芽方法浸根方法單倍體植株的二倍化第三十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日花藥培養(yǎng)脫毒1974年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；花藥采取時期單核期：花蕾4-6mm，花藥1mm花藥誘導愈傷組織培養(yǎng)基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L增殖培養(yǎng)基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+瓊脂7g/L生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+瓊脂7g/L第三十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日毛曼陀羅花藥培養(yǎng)，并誘發(fā)再生植株第三十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日三、花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)成苗途徑與花藥培養(yǎng)比較:

相同點：胚狀體成苗途徑、愈傷組織再分化成苗途徑

不同點：花粉培養(yǎng)：需進行花粉的分離特殊的花粉誘導培養(yǎng)第三十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日一、花粉培養(yǎng)的操作過程選幼年玉蘭樹花蕾取下花蕾（鏡檢）預培養(yǎng)數(shù)天取花藥接種分離花粉藥壁向花粉提供營養(yǎng)物質(zhì)通過藥壁吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的外源物質(zhì)過濾離心再生低溫預處理消毒第三十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日二、培養(yǎng)基1.基本培養(yǎng)基2.激素種類和濃度3.蔗糖濃度第三十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日1、基本培養(yǎng)基MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)B5培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)N6培養(yǎng)基：適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)第三十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日

細胞分裂素可促進胚狀體形成

生長素可誘導愈傷組織形成細胞分裂素與生長素比值高時可誘導愈傷組織分化苗2、激素種類和濃度第三十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日較高濃度蔗糖可誘導花粉形成愈傷組織較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗3、蔗糖濃度第三十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日三、單倍體植株染色體加倍的方法單倍體植物天然發(fā)生的途徑：孤雌生殖無配子生殖孤雄生殖也稱單性生殖，即卵不