第3章基因工程（挖空版）

第三章基因工程第一節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具一、基因工程的概念1.基因工程的概念操作環(huán)境操作對象基因操作水平操作原理操作結(jié)果按照人類的需要改造生物的遺傳特性2．基因重組的類型（1）真核生物有性生殖過程中，減數(shù)分裂時發(fā)生的基因重組：①；②。（2）肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實驗中發(fā)生的基因重組。（3）基因工程中人工操作導致的基因重組。3．幾乎所有生物的DNA分子都是由形成的規(guī)則的結(jié)構(gòu)。4．所有生物都共用一套。5．目的基因可在受體細胞內(nèi)獨立表達的原因是是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)和功能單位，具有。二、分子手術(shù)刀—限制性內(nèi)切核酸酶1.全稱和簡稱全稱：__簡稱：___2.來源：主要是從___中分離純化出來的3.作用：①能夠識別__DNA分子的某種_。②使__鏈中__的___斷開。4.作用部位：___5.識別序列：大多數(shù)限制酶的識別序列由__個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由__個、__個或___的核苷酸組成。6.切割結(jié)果：DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式___和____。（1）EcoRⅠ限制酶切割EcoRⅠ識別序列為GAATTCEcoRⅠ切割部位為之間的磷酸二酯鍵（2）SmaⅠ限制酶切割SmaⅠ識別序列為CCCGGGSmaⅠ切割部位為之間的磷酸二酯鍵二、分子縫合針—DNA連接酶1.功能：將___，恢復被限制酶切開的___。2.分類和對比種類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源T4噬菌體特點只縫合末端縫合末端末端作用恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的3．比較與DNA有關(guān)的六種酶名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶DNA將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個連接為一個DNA分子DNA聚合酶或熱穩(wěn)定DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為解旋酶堿基對之間的DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為，形成兩條長鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個核糖核苷酸依次連接到單鏈末端三、分子運輸車——載體1．種類：質(zhì)粒、、動植物病毒等。2．常用載體——質(zhì)粒（1）本質(zhì)：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。（2）質(zhì)粒作為載體所具備的條件及原因條件原因穩(wěn)定存在并能能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴增有一個至多個位點可攜帶多個或多種外源基因具有特殊的便于重組DNA分子的無毒害作用對受體細胞無毒害作用，避免受體細胞受到損傷（3）作用①作為運輸工具，將外源基因?qū)?。②質(zhì)粒攜帶在細胞內(nèi)大量復制。探究.實踐：DNA的粗提取與鑒定1.提取思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學性質(zhì)方面存在的差異，選用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W方法對他們進行提取。2.提取原理：①DNA不溶于，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)；②DNA在中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。3.鑒定原理：在一定溫度下（沸水浴），DNA遇會呈現(xiàn)藍色，因此可以作為鑒定DNA的試劑。4.比較DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同溶解規(guī)律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA5．DNA粗提取中的注意事項（1）本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作實驗材料，原因是無細胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細胞作材料。（2）加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成。（3）二苯胺試劑要，否則會影響鑒定的效果。（4）提取植物細胞的DNA時，加入的，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。（5）在DNA進一步提純時，選用的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。第二節(jié)基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲?。ㄒ唬┠康幕虻暮Y選與獲取1.目的基因概念在基因工程的設(shè)計和操作中，用于____或___等的基因就是目的基因（根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指_____）。2.篩選目的基因的方法（1）從相關(guān)的____和____的基因中進行篩選。（2）獲取方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(從基因文庫中獲取,利用PCR技術(shù)擴增,通過化學方法人工合成))3.利用PCR獲取和擴增目的基因（1）PCR的概：PCR是____的縮寫，是一項根據(jù)__的原理，在__提供參與DNA復制的__與__，對__進行____的技術(shù)。①全稱：_____②原理：______③操作環(huán)境：_____④目的：_____⑤優(yōu)點：______（2）DNA體內(nèi)復制的條件參與的組分在DNA復制中的作用DNA母鏈提供DNA復制的4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的解旋酶打開DNA雙鏈DNA聚合酶催化合成DNA引物使DNA聚合酶能夠從端開始連接脫氧核苷酸注：引物是一小段能與___的一段堿基序列___的___。（3）DNA體外復制（PCR）的條件參與的組分在DNA復制中的作用DNA母鏈提供DNA復制的4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的引物使DNA聚合酶能夠從端開始連接脫氧核苷酸90℃以上高溫打開DNA雙鏈（變性溫度）耐高溫的催化合成DNA子鏈緩沖液（含)激活真核細胞和細菌的其他不同的溫度需要不同溫度注：復制的原料實為（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同時水解產(chǎn)生能量為合成DNA子鏈提供能量，因此體系中不需要添加。（4）過程目的基因DNA____后__，_與單鏈相應__結(jié)合；然后以____為模板在__作用下進行___，即將4種___加到____，如此____，每次循環(huán)一般可以分為__三步。注：溫度上升到90℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈復性溫度下降到55℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合溫度上升到72℃左右，Taq酶從引物起始合成互補鏈，可使新鏈由′′端延伸拓展：DNA復制的相關(guān)計算1.子代DNA分子總數(shù)：__個；2.第n代產(chǎn)生的DNA數(shù)：__個；3.子代DNA脫氧核苷酸鏈總數(shù)=__條4.第n代產(chǎn)生的DNA鏈數(shù)：__條①n代后，DNA分子有__個②n代后，DNA鏈有__條③第__代出現(xiàn)完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有___個⑤n代后，共消耗__個引物⑥第n代復制，消耗了__個引物⑦n代后，完整的目的基因有__個4.獲取目的基因的其他方法（1）構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因：將含有某種生物不同基因的許多片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。①：包含一種生物所有的基因。②：只包含一種生物一部分基因，如cDNA文庫。（2）利用化學方法人工合成：用DNA合成儀，要獲取的基因比較小，核苷酸序列又已知，不需要模板。（二）基因表達載體的構(gòu)建（核心）1.基因表達載體的組成基因表達載體必須包括__、___、__、__等（若需要能完成自主復制，還應有__）。（1）啟動子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的__片段。②位置：位于基因的__，緊挨____。③功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，___。④特殊類型：____。⑤誘導型啟動子的特點：當誘導物存在時，__。（2）終止子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的___片段。②位置：位于基因的__。③功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方__。注：啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比比較項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNA片段DNA片段mRNA上mRNA上三個相鄰的堿基位置目的基因上游目的基因mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號（不編碼氨基酸）（3）標記基因①作用：__②常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等（4）基因表達載體的構(gòu)建過程一般用同種或能產(chǎn)生相同末端的酶分別切割載體和含有目的基因的DNA片段，再利用酶將目的基因片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。（三）將目的基因?qū)胧荏w細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎ǚ酃芡ǖ婪ǎ?）操作方式①用___將___直接注入__中。②在__的一定時間內(nèi)，__，將_____滴加在___上，使目的基因借助___進入__。（2）受體細胞：___。2.將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)__。注：此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。（2）農(nóng)桿菌特點：①能在自然條件下侵染___和___，而對大多數(shù)___沒有侵染能力。②農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有___，當它侵染植物細胞后，能將__上的_（）_到被侵染的細胞，并且將其____。（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：將目的基因插入___中，通過農(nóng)桿菌的__作用，就可以使目的基因__，并_____，使目的基因能夠___。3.將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射法1.受體細胞：__注：受精卵容易表現(xiàn)出全能性。并提純2.過程并提純利用利用將表達載體注入動物的中獲得獲得4.將目的基因?qū)胛⑸锛毎狢a2+處理法（1）受體細胞：常用____作為受體細胞，其中以___最廣泛（2）原核生物的優(yōu)點：___（3）Ca2+處理法（）的一般過程：——Ca——Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性大腸桿菌——這種細胞稱為感受態(tài)細胞——這種細胞稱為感受態(tài)細胞使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達載體導入將重組的基因表達載體導入其中——一般利用溫度變化導入（四）目的基因的檢測與鑒定檢測目的檢測方法判斷標準目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNA技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶個體水平的檢測如抗蟲、抗病的接種實驗是否表現(xiàn)出相應的特性1.DNA片段的電泳鑒定（1）實驗原理：DNA分子具有可解離的，在一定的pH下，這些基團可以帶上。帶電粒子在電場作用下，向與其攜帶的電極移動。（2）影響DNA分子的遷移率的因素：。（3）電泳出現(xiàn)位置不等的幾條條帶，說明存在長短不一的DNA片段，鑒定的PCR產(chǎn)物不純凈。第三節(jié)基因工程的應用一、基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應用分類實例處理或作用轉(zhuǎn)基因抗蟲棉、玉米、大豆、水稻和馬鈴薯從某些生物中分離出抗蟲基因?qū)胱魑铮怪哂锌瓜x性狀。可減少因的使用而造成的環(huán)境污染和對人類健康的損害，?。轉(zhuǎn)基因抗病植物抗病毒轉(zhuǎn)基因甜椒、番木瓜和煙草等將源于某些病毒、真菌等的抗病基因?qū)胱魑?培育出抗病作物?？共《镜哪康幕蚩拐婢哪康幕蚩钩輨┯衩?、轉(zhuǎn)魚抗寒基因番茄等：調(diào)節(jié)細胞滲透壓的基因(提高作物抗鹽堿、抗干旱)；抗除草劑基因；魚的抗凍蛋白基因。改良植物的品質(zhì)高賴氨酸玉米、含大量纖維素的轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因矮牽牛改善植物的含量（如氨基酸、蛋白質(zhì)）或提升觀賞價值等。提高動物的轉(zhuǎn)生長激素基因的鯉魚由于外源生長激素基因的表達可以使轉(zhuǎn)基因動物，可將這類基因?qū)雱游矬w內(nèi)，以提高動物的。改善畜產(chǎn)品的轉(zhuǎn)腸乳糖酶基因牛將腸乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M，使獲得的轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低。二、基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應用分類實例處理或作用轉(zhuǎn)基因動物（乳房生物反應器）將藥用蛋白基因與的基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起。轉(zhuǎn)基因動物作克隆豬器官抑制或除去決定基因，結(jié)合克隆技術(shù)培育出沒有的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。?基因治療鐮狀細胞貧血的治療方案基因治療的策略主要有基因置換、等。三、基因工程在食品工業(yè)方面的應用淀粉酶、凝乳酶、天冬氨酸和苯丙氨酸等的生產(chǎn)利用基因工程菌用酶、氨基酸和維生素等。如將編碼牛凝乳酶的基因?qū)氪竽c桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中，再通過生產(chǎn)凝乳酶。四、乳腺生物反應器與基因工程菌生產(chǎn)藥物比較比較項目乳腺生物反應器工程菌基因表達合成的與相同細菌細胞內(nèi)沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器，產(chǎn)生的藥物蛋白可能沒有。受體細胞動物的微生物細胞導入目的基因的方式從動物乳汁中提取從微生物細胞中提取第四節(jié)基因工程的延伸——蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程：是指以蛋白質(zhì)分子的及其與的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過改造或合成基因，來改造現(xiàn)有，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。1.概念理解（1）基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系。（2）操作：或基因合成。?（3）結(jié)果：現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造出。?（4）目的：根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對進行分子設(shè)計。?2.操作過程從預期的蛋白質(zhì)出發(fā)→設(shè)計預期的→推測應有的→找到并改變相對應的基因）或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)。二、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由1.基因工程的實質(zhì)：將一種生物的_轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，后者可以產(chǎn)生它，進而表現(xiàn)出。2.基因工程的局限性：______3.蛋白質(zhì)工程崛起的緣由：（1）基因工程原則上只能生產(chǎn)自然界中已存在的。（2）天然蛋白質(zhì)是生物長期進化過程中形成的，它們的結(jié)構(gòu)和功能符合，卻不一定完全符合人類的需要。二、蛋白質(zhì)工程的基本原理1.蛋白質(zhì)工程的目標：根據(jù)人們對蛋白質(zhì)___的特定需求，因此要對蛋白質(zhì)的___進行設(shè)計改造。2.蛋白質(zhì)工程的實質(zhì)：__（定向改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造新的蛋白質(zhì)）。3.天然蛋白質(zhì)合成過程：天然蛋白質(zhì)合成的過程是按照__進行的?；颉纬删哂刑囟ò被嵝蛄械亩嚯逆湣纬删哂懈呒壗Y(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)→形式生物功能4.蛋白質(zhì)工程思路蛋白質(zhì)工程與天然蛋白質(zhì)合成的過程__，而從___出發(fā)→設(shè)計__→推測___→找到并改變__或___→獲得所需要的蛋白質(zhì)。三、蛋白質(zhì)工程和基因工程的比較比較項目蛋白質(zhì)工程基因工程操作對象基因操作起點預期蛋白質(zhì)功能目的基因操作水平DNA分子水平操作流程預期蛋白質(zhì)功能→