植物胚胎培養(yǎng)

植物胚胎培養(yǎng)包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)和試管受精等內(nèi)容。

植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎結(jié)構(gòu)植物胚胎培養(yǎng)一、胚胎培養(yǎng)概念1、胚胎培養(yǎng)指使胚或具胚器官在離體無(wú)菌條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。廣義胚胎培養(yǎng)研究還包括胚乳培養(yǎng)和試管受精等技術(shù)。植物胚胎培養(yǎng)胚電鏡掃描圖片2、胚培養(yǎng)指在無(wú)菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來(lái)，置于培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)的方法。植物胚胎培養(yǎng)雙子葉植物胚植物胚胎培養(yǎng)3、胚乳培養(yǎng)指處于細(xì)胞期的胚乳組織的離體培養(yǎng)。4、胚珠培養(yǎng)指未受精或受精后的胚珠離體培養(yǎng)。植物胚胎培養(yǎng)不同植物的胚珠形態(tài)結(jié)構(gòu)植物胚胎培養(yǎng)倒生胚珠植物胚胎培養(yǎng)5、子房培養(yǎng)指授粉和未授粉的子房培養(yǎng)。它對(duì)于研究果實(shí)發(fā)育的生理、離體受精等有重要意義。6、試管受精指在無(wú)菌條件下培養(yǎng)離體的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌發(fā)產(chǎn)生的花粉進(jìn)入胚珠而完成受精過(guò)程。植物胚胎培養(yǎng)二、胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用1、克服遠(yuǎn)緣雜交的不育性，獲稀有雜種植物2、打破種子休眠，提早結(jié)實(shí)，縮短育種年限3、使生活力低下或無(wú)生活力的種子萌發(fā)4、使柑橘類植物合子胚正常發(fā)育5、測(cè)定種子生活力6、獲三倍體或單倍體植株7、快速繁殖特殊植物8、用于理論研究植物胚胎培養(yǎng)

指在無(wú)菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來(lái)，置于培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)的方法。三、胚的培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)植物胚結(jié)構(gòu)植物胚胎培養(yǎng)胚電鏡掃描圖片植物胚胎培養(yǎng)雙子葉植物胚植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)圖示為胚珠和胚囊的發(fā)育過(guò)程

孢原細(xì)胞減數(shù)分裂（大孢子母細(xì)胞）中央細(xì)胞植物胚胎培養(yǎng)幼胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)

據(jù)培養(yǎng)目的不同剝?nèi)〉碾x體胚發(fā)育時(shí)期的不同胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)一般較易獲得成功植物胚胎培養(yǎng)（一）幼胚培養(yǎng)幼胚完全是異養(yǎng)的，離體條件下培養(yǎng)要求培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)不易成功。

幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)：取材時(shí)期幼胚剝離培養(yǎng)條件的控制（是否需要特殊處理）植物胚胎培養(yǎng)

幼胚培養(yǎng)時(shí)，其發(fā)育過(guò)程有以下幾種發(fā)育方式：

a、胚性發(fā)育，此種方式不能萌發(fā)成苗

b、早熟萌發(fā)，長(zhǎng)成的苗十分瘦弱

c、產(chǎn)生愈傷組織，再由愈傷組織分化形成胚或不定芽植物胚胎培養(yǎng)(1)、胚性發(fā)育(embryonaldevelopment)幼胚接種到培養(yǎng)基上以后，仍然按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式發(fā)育，最后形成成熟胚(有時(shí)甚至可能類似種子)，然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株，這種途徑發(fā)育的幼胚一般一個(gè)幼胚將來(lái)就是一個(gè)植株。幼胚離體培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育方式植物胚胎培養(yǎng)(2)、早熟萌發(fā)(earlymaturesprouting)幼胚接種后，離體胚不繼續(xù)胚性生長(zhǎng)，而是在培養(yǎng)基上迅速萌發(fā)成幼苗，通常稱之為早熟萌發(fā)。在大多數(shù)情況下，一個(gè)幼胚萌發(fā)成一個(gè)植株，但有時(shí)會(huì)由于細(xì)胞分裂產(chǎn)生大量的胚性細(xì)胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現(xiàn)象就是所謂的叢生胚現(xiàn)象。

(3)、愈傷組織(callus)在許多情況下，幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。一般來(lái)講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。植物胚胎培養(yǎng)（二）成熟胚培養(yǎng)成熟胚是自養(yǎng)的，培養(yǎng)基需要簡(jiǎn)單。主要目的:◆研究胚發(fā)育過(guò)程的形態(tài)建成◆生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用◆胚與胚乳相互關(guān)系和營(yíng)養(yǎng)要求植物胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)方法：A、將受精后成熟或未成熟種子或果實(shí)，用70%—75%酒精表面消毒消毒幾分鐘B、用0.1%升汞溶液或飽和漂白粉溶液消毒10min，無(wú)菌水反復(fù)沖洗C、無(wú)菌操作臺(tái)上，直接或在解剖鏡下剝?nèi)∨呓臃N在培養(yǎng)基上植物胚胎培養(yǎng)

胚齡

胚長(zhǎng)度（μm）

營(yíng)養(yǎng)需要（培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)）早球形胚后球形胚心形胚魚雷胚成熟胚20~6061~8081~450451~700700（最大極限）小于40μm長(zhǎng)的胚所需營(yíng)養(yǎng)尚不清楚大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%、IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L大量元素、微量元素、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、VB6、煙酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%薺菜不同發(fā)育時(shí)期胚培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需要植物胚胎培養(yǎng)

胚乳是由兩個(gè)單倍的極核和一個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的3倍體組織。由它可獲得無(wú)子結(jié)實(shí)的3倍體植株，進(jìn)而可將它加倍成6倍體植株。

不同胚乳發(fā)育類型及發(fā)育時(shí)期直接影響外植體取材時(shí)期以及胚乳細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織頻率。胚乳培養(yǎng)的后代，常發(fā)生細(xì)胞染色體數(shù)目變化，形成多倍體、非整倍體等。四、胚乳培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)1、核型胚乳

◆被子植物中普遍的胚乳發(fā)育形式◆初生胚乳核的第一次分裂和以后的多次分裂，都不伴隨壁的形成◆各個(gè)胚乳核呈游離狀態(tài)分布在胚囊中◆發(fā)育到一定階段后，常在胚囊外圍的胚乳核之間出現(xiàn)細(xì)胞壁

◆為單子葉植物和具有離瓣花的雙子葉植物中普遍存在，如小麥、水稻、玉米、棉花、油菜、蘋果等（一）胚乳的發(fā)育類型

植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)2、細(xì)胞型胚乳

特點(diǎn)：◆初生胚乳核的分裂開(kāi)始，即產(chǎn)生細(xì)胞壁，形成胚乳細(xì)胞◆無(wú)游離核時(shí)期大多數(shù)雙子葉合瓣花植物是這樣的胚乳，如番茄、煙草、芝麻等。植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)3、沼生目型胚乳

◆核型胚乳與細(xì)胞型胚乳的中間類型◆初生胚乳核的第一次分裂將胚囊分隔為兩室，其中珠孔端室比合點(diǎn)端室寬大◆核進(jìn)行分裂形成狀態(tài)的游離核，最后形成細(xì)胞植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)（二）胚乳培養(yǎng)的關(guān)鍵A、胚乳發(fā)育時(shí)期的影響發(fā)育早期胚乳：操作不便，誘導(dǎo)率低游離核期或剛轉(zhuǎn)入細(xì)胞期的核型胚乳：難得callus旺盛生長(zhǎng)期胚乳：易誘導(dǎo)產(chǎn)生callus植物胚胎培養(yǎng)★旺盛期胚乳特征

§胚已分化完成

§胚乳已形成細(xì)胞組織

§充分生長(zhǎng)，達(dá)到成熟大小

§外觀為半透明的固體狀

§富有彈性植物胚胎培養(yǎng)水稻：授粉后4d黑麥草：授粉后8~10d黃瓜：授粉后7~16d梨：授粉后20d大麥：授粉后10~20d玉米和小麥：授粉后8~12d一些草本植物胚乳培養(yǎng)的適宜取材時(shí)期一般情況下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus誘導(dǎo)率很低，甚至無(wú)callus木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和誘導(dǎo)產(chǎn)生callus植物胚胎培養(yǎng)B、培養(yǎng)基和激素的影響培養(yǎng)基：MS、B5、MT、White、LS等水解酪蛋白、酵母提取物也很必要

激素：要求特殊大麥胚乳只有在添加2，4-D的培養(yǎng)基上才能生長(zhǎng)獼猴桃胚乳培養(yǎng)中，玉米素最好棗的胚乳培養(yǎng)中，激素似乎無(wú)特殊要求植物胚胎培養(yǎng)C、其他因素的影響蔗糖濃度：3%~5%溫度：25℃pH值：如玉米6.1~7.0；蘋果6.0~6.2等植物胚胎培養(yǎng)（三）培養(yǎng)方法：A、取授粉4-8d后的幼果，常規(guī)消毒B、無(wú)菌條件下切開(kāi)果實(shí)，取出種子，分離出胚乳C、接種在培養(yǎng)基上，在25-27℃和黑暗條件或散射光下培養(yǎng)形成愈傷組織D、轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，待愈傷組織長(zhǎng)出芽后，切下不定芽E、插入生根培養(yǎng)基中，光下培養(yǎng)10-15d，切口處長(zhǎng)出白色的不定根植物胚胎培養(yǎng)※兩種植物胚乳培養(yǎng)的方法A、枸杞開(kāi)花20d的枸杞胚乳MS+2，4-D0.2mg/L生根MS分化出苗MS+BA0.2mg/L

不同倍性的胚乳植株callus植物胚胎培養(yǎng)B、葡萄

取出種子切去合點(diǎn)部分接種White+CM10%+2，4-D2.0+CH500+KT1.0+蔗糖3%~4%瓊脂8%1個(gè)月，胚乳愈傷組織長(zhǎng)大，胚解體植物胚胎培養(yǎng)

未授粉胚珠和子房培養(yǎng)是離體受精的基礎(chǔ)，可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體植株，且孤雌產(chǎn)生的單倍體植株獲得率較孤雄生殖高。胚珠培養(yǎng)中，已授粉具有球形胚或更后期的胚珠易培養(yǎng)成種子，且培養(yǎng)基及添加成分相對(duì)要求不高。而受精不久的胚珠則需要成分復(fù)雜的培養(yǎng)基，培養(yǎng)難度大。

五、胚珠和子房培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)1、胚珠培養(yǎng)的意義有利于合子和早期原胚的培養(yǎng)胚分化不全的種子的胚培養(yǎng)獲得雜交后代和優(yōu)良品種離體授粉的需要獲得無(wú)病毒苗（一）胚珠培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)2、胚珠培養(yǎng)的方法長(zhǎng)度小于3mm的胚珠，難與直接解剖，可先接種于液體培養(yǎng)基中，根據(jù)培養(yǎng)情況采取相應(yīng)培養(yǎng)條件。植物胚胎培養(yǎng)（二）子房培養(yǎng)1、子房培養(yǎng)的意義

★有效地挽救雜種胚的敗育★單倍體植株的培育★離體授粉的需要★離體條件形成果實(shí)★花被功能研究植物胚胎培養(yǎng)2、子房培養(yǎng)的方法授粉前或授粉后的子房表面消毒接種培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)

受精后的子房仍需進(jìn)行表面消毒后再接種。而未受精子房可將花被表面消毒后，在無(wú)菌條件下直接剝?nèi)∽臃拷臃N。子房培養(yǎng)只需較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基即可形成果實(shí)，并含成熟種子。植物胚胎培養(yǎng)六、植物離體授粉受精離體受精（IVF）

指在離體環(huán)境中完成被子植物的精、卵融合而且利用受精所產(chǎn)生的“離體合子”培養(yǎng)再生植株，做到整個(gè)受精與胚胎發(fā)育過(guò)程完全在離體條件下完成。（90年代）植物胚胎培養(yǎng)離體受精技術(shù)的突破的技術(shù)前提：

a、雌配子和雄配子分離技術(shù)

b、單對(duì)原生質(zhì)體融合技術(shù)

c、微培養(yǎng)技術(shù)（將商品生產(chǎn)的微室置入飼養(yǎng)細(xì)胞的小培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)物接微室內(nèi)，通過(guò)室底部微孔濾膜吸取周圍飼養(yǎng)細(xì)胞釋放的活性物質(zhì)，促進(jìn)其發(fā)育）植物胚胎培養(yǎng)

開(kāi)花前數(shù)天套袋，開(kāi)花前一天或當(dāng)天取花蕾或花藥，表面消毒后，無(wú)菌條件下收集花粉。采用直接引入法、注射法進(jìn)行子房試管授粉，或者是采用哺育法、接近法進(jìn)行胚珠試管授粉。1、離體受精方法植物胚胎培養(yǎng)胚珠花粉試管內(nèi)授粉10d后胚珠培養(yǎng)3周后離體受精及植株再生過(guò)程植物胚胎培養(yǎng)2、技術(shù)關(guān)鍵A、花粉的采集和滅菌

★確定開(kāi)花、花藥分裂、授粉、花粉管進(jìn)入胚珠和受精作用時(shí)間★去雄后將花蕾套袋隔離★采集花粉粒★消毒★無(wú)菌條件分裂花粉★授粉植物胚胎培養(yǎng)B、外植體選擇★開(kāi)花前套袋、去雄★開(kāi)花后1~2d，采集花蕾，放入無(wú)菌室培養(yǎng)準(zhǔn)備★切去柱頭，防止不授粉★胚珠剝離時(shí)間（開(kāi)花后1~2d效果好）植物胚胎培養(yǎng)C、適合的培養(yǎng)基離體受精的主要過(guò)程⊙花粉的萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)，受精⊙受精胚珠發(fā)育為成熟的種子，存在生活力的胚培養(yǎng)基應(yīng)促進(jìn)受精后的胚珠正常發(fā)育植物胚胎培養(yǎng)離體受精胚珠培養(yǎng)的改良Nitsch（1951）培養(yǎng)基配方成分?jǐn)?shù)量（mg/L）成分?jǐn)?shù)量（mg/L）成分?jǐn)?shù)量（mg/L）Ca（NO3）24H2O500ZnSO47H2O0.5VB10.25KNO3125MnSO44H2O3.0VB60.25KH2PO4125H3BO30.5煙酸1.25MgSO47H2O125FeC6O5H75H2O10.0蔗糖50000CuSO45H2O0.025Gly7.5瓊脂7000Na2MoO40.025泛酸鈣0.25蔗糖濃度是4%~5%，水解酪蛋白為500mg/L，利于花粉萌發(fā)和種子發(fā)育植物胚胎培養(yǎng)3、離體受精障礙★花粉在柱頭上不萌發(fā)★花粉管不能進(jìn)入胚珠★花粉在花柱中破裂★受精后，胚和胚乳之間的不親和性★受精后，胚乳發(fā)育不良★雜種胚不能發(fā)育成熟植物胚胎培養(yǎng)4、離體受精的細(xì)胞學(xué)研究現(xiàn)狀（1）配子識(shí)別——判別糖蛋白的作用利用分離的雌、雄配子對(duì)其細(xì)胞膜特征，如表面膜蛋白特別是糖蛋白的分布等直接進(jìn)行分析，這可以