顯微鑒別操作方法

顯微鑒別操作方法（2015版中國藥典）顯微鑒別法系指用顯微鏡對中藥藥材（飲片）切片、粉末、解離組織或表面制片及含飲片粉末的制劑中飲片的組織、細胞或內(nèi)含物等特征進行鑒別的一種方法。鑒別時選擇具有代表性的供試品，根據(jù)各品種鑒別項的規(guī)定制片。制劑根據(jù)不同劑型適當處理后制片。一、藥材（飲片）顯微制片1.橫切片或縱切片制片取供試品欲觀察部位，經(jīng)軟化處理后，用徒手或滑走切片法，切成10?20um的薄片，必要時可包埋后切片。選取平整的薄片置載玻片上，根據(jù)觀察對象不同，滴加甘油醋酸試液、水合氯醛試液或其他試液1?2滴，蓋上蓋玻片。必要時滴加水合氯醛試液后，在酒精燈上加熱透化，并滴加甘油乙醇試液或稀甘油，蓋上蓋玻片。粉末制片供試品粉末過四或五號篩，挑取少許置載玻片上，滴加甘油醋酸試液、水合氯醛試液或其他適宜的試液，蓋上蓋玻片。必要時，按上法加熱透化。表面制片將供試品濕潤軟化后剪取欲觀察部位約4mm2,—正一反置載玻片上，或撕取表皮，加適宜的試液或加熱透化后，蓋上蓋玻片。解離組織制片將供試品切成長約5mm、直徑約2mm的段或厚約1mm的片，如供試品中薄壁組織占大部分，木化組織少或分散存在，采用氫氧化鉀法，若供試品質(zhì)地堅硬，木化組織較多或集成較大群束，采用硝鉻酸法或氯酸鉀法。（1） 氫氧化鉀法將供試品置試管中，加5%氫氧化鉀溶液適量，加熱至用玻璃棒擠壓能離散為止，傾去堿液，加水洗滌后，取少量置載玻片上，用解剖針撕開，滴加稀甘油，蓋上蓋玻片。（2） 硝鉻酸法將供試品置試管中，加硝鉻酸試液適量，放置至用玻璃棒擠壓能離散為止，傾去酸液，加水洗滌后，照上法裝片。（3）氯酸鉀法將供試品置試管中，加硝酸溶液（1-2）及氯酸鉀少量，緩緩加熱，待產(chǎn)生的氣泡漸少時，再及時加入氯酸鉀少量，以維持氣泡穩(wěn)定地發(fā)生，至用玻璃棒擠壓能離散為止，傾去酸液，加水洗滌后，照上法裝片?；ǚ哿Ｅc孢子制片取花粉、花藥（或小的花）、孢子或孢子囊群（干燥的供試品浸于冰醋酸中軟化），用玻璃棒研碎，經(jīng)紗布過濾至離心管中，離心，取沉淀加新配制的醋酐與硫酸（9:1）的混合液1?3ml，置水浴上加熱2?3分鐘，離心，取沉淀，用水洗滌2次，取沉淀少量置載玻片上，滴加水合氯醛試液，蓋上蓋玻片，或加50%甘油與1%苯酚各1?2滴，用品紅甘油膠［取明膠1g,加水6ml,浸泡至溶化，再加甘油7ml，加熱并輕輕攪拌至完全混勻，用紗布過濾至培養(yǎng)皿中,加堿性品紅溶液（堿性品紅0.1g，加無水乙醇600ml及樟油80ml，溶解）適量，混勻，凝固后即得］封藏。磨片制片堅硬的動物、礦物類藥，可采用磨片法制片。選取厚度1?2mm的供試材料，置粗磨石（或磨砂玻璃板）上，加適量水，用食指、中指夾住或壓住材料，在磨石上往返磨礪，待兩面磨平，且厚度約數(shù)百微米時，將材料移置細磨石上，加水，用軟木塞壓在材料上，往返磨礪至透明，用水沖洗，再用乙醇處理和甘油乙醇試液裝片。二、 含飲片粉末的制劑顯微制片按供試品不同劑型，散劑、膠囊劑（內(nèi)容物為顆粒狀，應研細），可直接取適量粉末；片劑取2?3片，水丸、糊丸、水蜜丸、錠劑等（包衣者除去包衣），取數(shù)丸或1?2錠，分別置乳缽中研成粉末，取適量粉末；蜜丸應將藥丸切開，從切面由外至中央挑取適量樣品或用水脫蜜后，吸取沉淀物少量。根據(jù)觀察對象不同，分別按粉末制片法制片（1?5片）。三、 細胞壁性質(zhì)的鑒別木質(zhì)化細胞壁 加間苯三酚試液1?2滴，稍放置，加鹽酸1滴，因木質(zhì)化程度不同，顯紅色或紫紅色。木栓化或角質(zhì)化細胞壁 加蘇丹III試液，稍放置或微熱，顯橘紅色至紅色。3.纖維素細胞壁 加氯化鋅碘試液，或先加碘試液濕潤后，稍放置，再加硫酸溶液（33-50）,顯藍色或紫色。4.硅質(zhì)化細胞壁加硫酸無變化。四、細胞內(nèi)含物性質(zhì)的鑒別1.淀粉粒（1） 加碘試液，顯藍色或紫色。（2） 用甘油醋酸試液裝片，置偏光顯微鏡下觀察，未糊化的淀粉粒顯偏光現(xiàn)象；已糊化的無偏光現(xiàn)象。糊粉粒（1）加碘試液，顯棕色或黃棕色。（2）加硝酸汞試液，顯磚紅色。材料中如含有多量脂肪油，應先用乙醚或石油醚脫脂后進行試驗。脂肪油、揮發(fā)油、樹脂（1）加蘇丹III試液，顯橘紅色、紅色或紫紅色。（2）加90%乙醇，脂肪油和樹脂不溶解（蓖麻油及巴豆油例外），揮發(fā)油則溶解。菊糖加10%a-萘酚乙醇溶液，再加硫酸，顯紫紅色并溶解。黏液加釕紅試液，顯紅色。草酸鈣結(jié)晶（1）加稀醋酸不溶解，加稀鹽酸溶解而無氣泡發(fā)生。（2）加硫酸溶液（1-2）逐漸溶解，片刻后析出針狀硫酸鈣結(jié)晶。碳酸鈣結(jié)晶（鐘乳體） 加稀鹽酸溶解，同時有氣泡發(fā)生。硅質(zhì)加硫酸不溶解。五、顯微測量系指用目鏡測微尺，在顯微鏡下測量細胞及細胞內(nèi)含物等的大小。目鏡測微尺放在目鏡筒內(nèi)的一種標尺，為一個直徑18~20mm的圓形玻璃片，中央刻有精確等距離的平行線刻度，常為50格或100格（圖1）。載物臺測微尺在特制的載玻片中央粘貼一刻有精細尺度的圓形玻片。通常將長1mm（或2mm）精確等分成100（或200）小格，每1小格長為10Mm，用以標定目鏡測微尺（圖2）。:II0102030405060708090100ffi2載物臺測微尺圖1:II0102030405060708090100ffi2載物臺測微尺圖1目鏡測微尺I恪等Tl/IOOmm☆WttWt尺仆為200格3.目鏡測微尺的標定用以確定使用同一顯微鏡及特定倍數(shù)的物鏡、目鏡和鏡筒長度時，目鏡測微尺上每一格所代表的長度。

取載物臺測微尺置顯微鏡載物臺上，在高倍物鏡（或低倍物鏡）下，將測微尺刻度移至視野中央。將目鏡測微尺（正面向上）放入目鏡鏡筒內(nèi)，旋轉(zhuǎn)目鏡，并移動載物臺測微尺，使目鏡測微尺的“0”刻度線與載物臺測微尺的某刻度線相重合，然后再找第二條重合刻度線，根據(jù)兩條重合線間兩種測微尺的小格數(shù)，計算出目鏡測微尺每一小格在該物鏡條件下相當?shù)拈L度（Mm）,如圖3所示，目鏡測微尺77個小格（0?77）與載物臺測微尺的30個小格（0.7?1.0）相當，已知載物臺測微尺每一小格的長度為10Mm。目鏡測微尺每一小格長度為：10MmX30F77=3.8mm。當測定時要用不同的放大倍數(shù)時，應分別標定。11111111111111111111111111110K)2030屮11圖3表示視野中目鏡測微尺與載物臺測微尺的重合線測量方法將需測量的目的物顯微制片