2022年醫(yī)學(xué)專題-土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

課題(kètí)2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專題2微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與應(yīng)用第一頁(yè)，共三十八頁(yè)。一、課題(kètí)背景1、尿素(niàosù)的利用

尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能(cáinéng)被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因

土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3第二頁(yè)，共三十八頁(yè)。3、常見(jiàn)(chánɡjiàn)的分解尿素的微生物(異養(yǎng)需氧型)芽孢桿菌(gǎnjūn)、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌。硝化細(xì)菌、固氮菌、根瘤菌：硝化細(xì)菌固氮菌根瘤菌代謝方式自養(yǎng)需氧型異養(yǎng)需氧型異養(yǎng)需氧型能量來(lái)源NH3有機(jī)物豆科植物的有機(jī)物轉(zhuǎn)換過(guò)程將NH3轉(zhuǎn)變成NO2-、NO3-固氮酶催化機(jī)理總反應(yīng)式為：

N2+8

e-+8

H++16

Mg·ATP+16

H2O→2

NH3+H2+16Mg·ADP

+

16

Pi在固氮酶的作用下，根瘤中的菌體將分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮（同左）第三頁(yè)，共三十八頁(yè)。4、課題(kètí)目的①?gòu)耐寥乐蟹蛛x出能夠分解尿素(niàosù)的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)(tǒngjì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對(duì)照第四頁(yè)，共三十八頁(yè)。1、實(shí)例(shílì)：?jiǎn)⑹荆簩ふ夷康木N時(shí)要根據(jù)(gēnjù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因?yàn)?yīnwèi)熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。第五頁(yè)，共三十八頁(yè)。2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選(shāixuǎn)原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)(tóngshí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。第六頁(yè)，共三十八頁(yè)。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌(xìjūn)的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①?gòu)奈锢硇再|(zhì)(wùlǐxìngzhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？固體(gùtǐ)培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素選擇培養(yǎng)基唯一氮源第七頁(yè)，共三十八頁(yè)?！妓伎?〗該培養(yǎng)基對(duì)微生物

（具有(jùyǒu)，不具有(jùyǒu)）選擇作用。如果具有(jùyǒu)，其選擇機(jī)制是

。具有(jùyǒu)只有能夠(nénggòu)以尿素作為氮源的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)第八頁(yè)，共三十八頁(yè)。培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能(cáinéng)分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基選擇(xuǎnzé)分解尿素的微生物的原理選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定(tèdìng)種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。第九頁(yè)，共三十八頁(yè)?！鶐追N(jǐzhǒnɡ)常見(jiàn)選擇培養(yǎng)基1、加入(jiārù)青霉素的培養(yǎng)基分離酵母菌、霉菌(méjūn)等真菌2、不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基分離固氮菌3、不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基分離自養(yǎng)型微生物4、加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基分離金黃色葡萄球菌第十頁(yè)，共三十八頁(yè)。1.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）（1）常用(chánɡyònɡ)方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋(xīshì)度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。

當(dāng)樣品的稀釋(xīshì)度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。（2）原理：稀釋涂布平板法。㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：第十一頁(yè)，共三十八頁(yè)。注意事項(xiàng):①為了保證(bǎozhèng)結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度涂布至少3個(gè)平板，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。第十二頁(yè)，共三十八頁(yè)。如何(rúhé)從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式(gōngshì)進(jìn)行計(jì)算教材(jiàocái)P22第十三頁(yè)，共三十八頁(yè)。2、顯微鏡直接(zhíjiē)計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定(yīdìng)容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計(jì)(tǒngjì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)第十四頁(yè)，共三十八頁(yè)。實(shí)例(shílì)分析P22

你認(rèn)為哪個(gè)(nǎge)同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)值？你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？第十五頁(yè)，共三十八頁(yè)。實(shí)例(shílì)分析P22

第一同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒(méi)有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果(jiēguǒ)不具有說(shuō)服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問(wèn)題，涂布了三個(gè)平板，但是其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來(lái)求平均值。第十六頁(yè)，共三十八頁(yè)。

設(shè)置對(duì)照的主要目的(mùdì)是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。（三）.設(shè)置(shèzhì)對(duì)照：

實(shí)例(shílì)：教材P23

原因：

⑴土樣不同⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))第十七頁(yè)，共三十八頁(yè)。小結(jié)：通過(guò)這個(gè)事例可以(kěyǐ)看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同(xiānɡtónɡ)土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明(zhèngmíng)培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。第十八頁(yè)，共三十八頁(yè)。菌落計(jì)數(shù)配制土壤溶液系列稀釋涂布平板與培養(yǎng)根據(jù)圖示2－7填寫(xiě)以下實(shí)驗(yàn)(shíyàn)流程：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：第十九頁(yè)，共三十八頁(yè)。

實(shí)驗(yàn)的具體操作

㈠.土壤取樣（微生物的天然培養(yǎng)基）

從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣（3-8cm），將樣品裝入事先準(zhǔn)備(zhǔnbèi)好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第二十頁(yè)，共三十八頁(yè)。

準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒(méi)有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基，5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8個(gè)滅菌(mièjūn)的試管和1個(gè)滅菌的移液管。第二十一頁(yè)，共三十八頁(yè)?！魬?yīng)在火焰旁稱取土壤(tǔrǎng)10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的(mùdì)：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板[三]樣品(yàngpǐn)的稀釋第二十二頁(yè)，共三十八頁(yè)。

為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量(shùliàng)，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層(shàngcéng)樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第二十三頁(yè)，共三十八頁(yè)。㈣.取樣(qǔyàng)涂布◆實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型(lèixíng)、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上(yǐshàng)菌落數(shù)目在30——300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明實(shí)驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第二十四頁(yè)，共三十八頁(yè)。㈤.微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與觀察

在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目(shùmù)。

選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。

培養(yǎng)(péiyǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)(péiyǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d

放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d

霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。第二十五頁(yè)，共三十八頁(yè)。

當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)(jìshù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。

第二十六頁(yè)，共三十八頁(yè)。微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與觀察第二十七頁(yè)，共三十八頁(yè)。（六）鑒定：篩選后必鑒定鑒別培養(yǎng)基：加入某種指示劑或化學(xué)藥品，不影響微生物的生存酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細(xì)菌。原理：脲酶催化(cuīhuà)尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅→脲酶陽(yáng)性第二十八頁(yè)，共三十八頁(yè)。三、操作(cāozuò)提示

無(wú)菌操作(cāozuò)

做好標(biāo)記(biāojì)

制定計(jì)劃

第二十九頁(yè)，共三十八頁(yè)。課題成果(chéngguǒ)與評(píng)價(jià)

（一）培養(yǎng)(péiyǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)(péiyǎng)基是否篩選出菌落

對(duì)照的培養(yǎng)(péiyǎng)皿在培養(yǎng)(péiyǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。第三十頁(yè)，共三十八頁(yè)。如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要(xūyào)進(jìn)一步分析產(chǎn)生差異的原因。（二）樣品的稀釋操作(cāozuò)是否成功

如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功(chénggōng)，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。

（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致第三十一頁(yè)，共三十八頁(yè)。1.水中大腸桿菌數(shù)目的檢測(cè)（P26）

伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基2.空氣中微生物總數(shù)的檢測(cè)3.牛奶中細(xì)菌的分離(fēnlí)與計(jì)數(shù)4.土壤中真菌（或放線菌）的分離與計(jì)數(shù)相關(guān)(xiāngguān)連接：第三十二頁(yè)，共三十八頁(yè)。相關(guān)(xiāngguān)連接：空氣中微生物總數(shù)(zǒngshù)的檢測(cè)第三十三頁(yè)，共三十八頁(yè)。本課題(kètí)知識(shí)小結(jié):第三十四頁(yè)，共三十八頁(yè)。1.對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（）

A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B.至少接種一種細(xì)菌

C.接種一個(gè)細(xì)菌D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細(xì)菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他(qítā)微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實(shí)踐(shíjiàn)訓(xùn)練A

CD第三十五頁(yè)，共三十八頁(yè)。4.下列說(shuō)法不正確的是（）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值

C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比(xiānɡbǐ)，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì)

C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽BC第三十六頁(yè)，共三十八頁(yè)。（09，寧夏，15分）（1）在大腸桿菌培養(yǎng)過(guò)程中，除考慮(kǎolǜ)營(yíng)養(yǎng)條件外，還要考慮(kǎolǜ)______、______和滲透壓等條件。由于該細(xì)菌具有體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、變異類型容易選擇、______、______等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為遺傳學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料。（2）在微生物培養(yǎng)操作過(guò)程中，為防止雜菌污染，需對(duì)培養(yǎng)