不同粒徑的二氧化鈦納米顆粒對巨噬細(xì)胞凋亡的作用,病理學(xué)論文

不同粒徑的二氧化鈦納米顆粒對巨噬細(xì)胞凋亡的作用,病理學(xué)論文納米二氧化鈦(粒徑＜100nm)具有超微性，紫外吸收性和高效光催化活性三大特性，這些特性與它的生物學(xué)特性密切相關(guān)。隨著納米二氧化鈦在生活生產(chǎn)中的廣泛運用，人們不可避免的接觸到含納米二氧化鈦的物品，納米二氧化鈦能夠通過吸入、攝食、皮膚浸透和注射等途徑進(jìn)入機體，過去的一段時間以為它是沒有毒性的，并作為陰性對照進(jìn)行粉塵的體內(nèi)和體外研究。納米級的顆粒通過吸入途經(jīng)進(jìn)入機體后，不同粒徑的顆粒沉積在肺的不同位置，肺泡的巨噬細(xì)胞具有辨別去除抗原性異物，介入和促進(jìn)炎癥反響經(jīng)過，對腫瘤和病毒感染等靶細(xì)胞的殺傷作用，專職的抗原提呈細(xì)胞，啟動特異性免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)等作用。TiO2-NPs通過呼吸道進(jìn)入體內(nèi)首先與肺泡巨噬細(xì)胞接觸，進(jìn)而可能產(chǎn)生各種健康效應(yīng)。凋亡指的是細(xì)胞在遭到刺激之后啟動的程序性死亡，是細(xì)胞產(chǎn)生的一種保衛(wèi)性措施。該研究以大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383作為研究對象，討論不同粒徑的二氧化鈦納米顆粒對巨噬細(xì)胞凋亡的影響。1、材料與方式方法1.1主要材料NR8383大鼠肺泡巨噬細(xì)胞由中山大學(xué)饋贈。二氧化鈦納米顆粒(TiO2-NPs)，共四種粒徑:(101.5)nm、(303)nm、(503)nm、(1005)nm，純度為99.9%，購買于北京納辰科技發(fā)展有限責(zé)任公司;CCK-8檢測試劑盒，Hoechst33258染色液，抗熒光猝滅封片液，碘化丙啶(PI)染色液均購自碧云天;F12K培養(yǎng)基購自北京邁晨科技;胎牛血清購自Gibco;青鏈霉素，HEPES購自北京索萊寶，多聚甲醛購自上海生工。1.2方式方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):NR8383細(xì)胞培養(yǎng)于含20%FBS(55℃滅活30min)，1%青鏈霉素，1%HEPES的F12K培養(yǎng)基，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。1.2.2二氧化鈦納米顆粒懸液制備:稱取不同粒徑TiO2-NPs50mg，分別溶于PBS，用電磁攪拌器初步混懸之后，并定容至100ml，超聲振蕩2h，制成500g/mlTiO2-NPs儲備染毒懸液，高壓滅菌備用。使用前，超聲振蕩20min，將儲備染毒懸液用F12K培養(yǎng)基逐級稀釋成實驗所需濃度使用。1.2.3細(xì)胞活力(CCK-8法):將NR8383細(xì)胞以5104個/孔，密度接種于96孔板，設(shè)三個復(fù)孔，在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)24h，分別參加等體積的濃度為0.2、1、5、25g/ml的TiO2-NPs處理NR8383細(xì)胞，48h后，每孔參加10lCCK-8試劑，37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)3h后用酶標(biāo)儀450nm波長下檢測各組細(xì)胞OD值，630nm為參考波長，進(jìn)行細(xì)胞比活力分析，正常細(xì)胞為對照組，培養(yǎng)基組為空白調(diào)零孔。活力比(%)=(實驗孔OD值－調(diào)零孔OD值)/(對照孔OD值－調(diào)零孔OD值)100%1.2.4核形態(tài)(Hoechst33258染色):選取濃度為25g/mlTiO2-NPs處理NR8383細(xì)胞48h后，離心收集細(xì)胞，PBS洗一次，重懸細(xì)胞，滴至干凈載玻片上，盡量使細(xì)胞分別均勻，稍晾干，4%多聚甲醛避光固定15min，去多聚甲醛后，滴加Hoechst33258染色液覆蓋細(xì)胞，避光染色5min，去染色液后滴加抗熒光猝滅封片液，蓋上蓋玻片于熒光倒置顯微鏡下觀察，未經(jīng)TiO2-NPs處理組為對照組。1.2.5細(xì)胞周期及凋亡實驗(PI染色):各濃度1、5、25g/ml組TiO2-NPs處理NR8383細(xì)胞48h后，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗一次，參加1ml冰浴預(yù)冷75%乙醇中，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。每管細(xì)胞樣品中參加0.5ml碘化丙啶(PI)染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴30min，流式細(xì)胞儀檢測。1.3統(tǒng)計學(xué)方式方法。實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，均數(shù)比擬采用單因素方差分析，多重比擬采用LSD法，P＜0.05以為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2、結(jié)果2.1細(xì)胞活力分析結(jié)果。如此圖1示，不同濃度不同粒徑TiO2-NPs作用48h后，NR8383細(xì)胞活力在同一粒徑下隨濃度增加而增加，同一濃度下隨粒徑增加而降低，粒徑為10nm，25g/ml時細(xì)胞活力最大，設(shè)正常對照組細(xì)胞活力為100%。2.2Hoechst33258染色。如此圖2示，經(jīng)Hoechst33258染色后熒光倒置顯微鏡下可見發(fā)生凋亡的細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，正常細(xì)胞核常呈現(xiàn)圓形，淡藍(lán)色，內(nèi)有較深藍(lán)色顆粒。吞噬較高濃度TiO2-NPs后的細(xì)胞核被擠壓到邊緣，外周能見到吞入到巨噬細(xì)胞內(nèi)部的模糊的納米顆粒陰影邊緣。從結(jié)果能夠看出熒光著色致密的細(xì)胞核數(shù)量增加。2.3細(xì)胞周期及凋亡實驗。如此圖3示，不同濃度不同粒徑TiO2-NPs作用48h后，NR8383細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡。隨粒徑大小增加凋亡率增加，隨濃度增加凋亡率也隨之增加。粒徑100nm，25g/ml時，凋亡率最大，與對照組凋亡率比擬均差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3、討論3.1細(xì)胞發(fā)生凋亡時，形態(tài)發(fā)生改變。細(xì)胞膜和細(xì)胞器保持相對完好，細(xì)胞整體皺縮，細(xì)胞核固縮，能被核染料如Hoechst33258等染色并呈現(xiàn)濃染，這些現(xiàn)象與細(xì)胞壞死時的細(xì)胞膜細(xì)胞器等構(gòu)造溶解、毀壞完全不同。細(xì)胞凋亡分為兩條途徑:一是細(xì)胞外的死亡受體途徑，另一條是細(xì)胞內(nèi)的線粒體途徑。死亡受體途徑主要是通過激活細(xì)胞內(nèi)的P53，F(xiàn)as，Bcl-2，NF-B等凋亡相關(guān)基因，由腫瘤壞死因子(TNF)受體家族介導(dǎo)，進(jìn)而進(jìn)一步激活Caspase-8。線粒體途徑是通過改變細(xì)胞線粒體的膜電位，細(xì)胞色素C釋放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，pH值下降，導(dǎo)致Caspase-9激活。兩個途徑都導(dǎo)致效應(yīng)性Caspase-3活化。3.2巨噬細(xì)胞是機體內(nèi)吞噬外來物質(zhì)的第一道防線，是機體重要的防御屏障。通過呼吸道進(jìn)入機體的顆粒，因粒徑不同，沉積在呼吸道的不同位置，對機體造成的影響也不一樣。粒徑＜2.5m的細(xì)顆粒物稱為PM2.5。與較粗的大氣顆粒物相比，PM2.5粒徑小，比面積大，活性強，且在大氣環(huán)境中的停留時間長、輸送距離遠(yuǎn)，因此對人體健康和大氣環(huán)境質(zhì)量的影響更大。跟PM2.5相比，納米顆粒的粒徑更小，比面積更大，對人體健康和大氣環(huán)境質(zhì)量的影響可能會更大，所以探尋求索納米顆粒不同粒徑不同濃度進(jìn)入呼吸道后，對機體組織細(xì)胞產(chǎn)生的影響研究是必要的。3.3有研究表示清楚TiO2-NPs能引起細(xì)胞的凋亡。TiO2-NPs刺激大鼠肺泡巨噬細(xì)胞之后，能引起細(xì)胞的凋亡，對細(xì)胞造成一定的損傷，這種效應(yīng)隨TiO2-NPs的粒徑和濃度變化。該研究結(jié)果也證實了這個結(jié)論，通過實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，不同粒徑TiO2-NPs刺激48h后，大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383細(xì)胞活力反而增加，這可能是NR8383細(xì)胞在遭到外源物刺激之后，辨別并吞噬外源物，巨噬細(xì)胞增殖以便消除外來物，但是TiO2-NPs被內(nèi)吞之后并不能被NR8383細(xì)胞消化最終消除。TiO2-NPs刺激48h后NR8383細(xì)胞伴隨有凋亡現(xiàn)象，凋亡程度隨粒徑和濃度變化。隨著TiO2-NPs粒徑10、30、50、100nmNR8383細(xì)胞凋亡增加，隨濃度0.2、1、5、25g/mlNR8383細(xì)胞凋亡增加。Kennedy，應(yīng)杏秋，閆慶倩等的研究能夠得知同一種物質(zhì)顆粒粒徑越小越容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。TiO2-NPs被內(nèi)吞進(jìn)入巨噬細(xì)胞之后，對細(xì)胞造成的損傷可能與抗氧化機制和炎癥反響有關(guān)系。實驗證明巨噬細(xì)胞內(nèi)吞TiO2-NPs之后，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-B表示出增加，它編碼很多與炎癥相關(guān)的炎癥介質(zhì)如TNF-，IL-1b，和MIP-2等。NF-B是核轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控細(xì)胞的多種生理功能。在凋亡的死亡受體途徑中，NF-B在TNF，IL等的刺激下啟動并調(diào)控凋亡。綜合以上實驗結(jié)果，NR8383細(xì)胞遭到TiO2-NPs刺激后能產(chǎn)生凋亡，結(jié)合其他研究者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這可能與NF-B的調(diào)控作用有密切關(guān)系，詳細(xì)的機制在今后的研究中還有待進(jìn)一步深切進(jìn)入的探究。以下為參考文獻(xiàn)：［1］LiSQ，ZhuRR，ZhuH，etal．NanotoxicityofTiO2nanoparticlestoerythrocyteinvitro．Foodandchemicaltoxicology:aninternationaljournalpublishedfortheBritishIndustrialBiologicalResearchAssociation，2008，46(12):3626－3631．［2］ZhaoJ，CastranovaV．Toxicologyofnanomaterialsusedinnanomedicine．JtoxicologyandenvironmentalhealthPartB，Criticalreviews，2018，14(8):593－632．［3］SangX，ZhengL，SunQ，etal．Thechronicspleeninjuryofmicefollowinglong-termexposuretotitaniumdioxidenanoparticles．JBioMatResPartA，2020，100(4):894－902．［4］YanQQ，YangL，ZhaoJ，etal．Comparativeexperimentonnanoparticle-inducedtoxicityinhumanvascularendothelialcells．ChineseJIndhygiene＆OccupDis，2020，30(11):820－824．［5］SharifiS，BehzadiS，LaurentS，etal．Toxicityofnanomaterials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