外周血的提取

外周血的提取第1頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗目的掌握人全血DNA提取的原理和操作步驟。了解DNA基本理化性質。3.初步了解DNA瓊脂糖電泳鑒定的方法。第2頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗原理1保證DNA一級結構的完整性；2其他生物分子如蛋白質、多糖和脂類等分子的污染應盡量降低到最低；3盡量去除對后續(xù)分子實驗有抑制作用的有機溶劑和重金屬離子；4其他核酸分子RNA，應根據實際需要處理。DNA提取總的原則第3頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗原理理論上所有真核細胞、原核細胞、病毒等都可以提取DNA。樣本選擇取決于實驗目的。全血是基因組提取中最常見的樣本之一。樣本來源第4頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三理化性質核酸是由堿基、戊糖及磷酸組成的生物大分子，分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）兩類。1.酸堿性核酸分子中有酸性的磷酸基和堿性的含氮堿基，屬于兩性化合物，但是磷酸基的酸性較強，所以核酸總體上表現為酸性，帶負電荷。2.溶解度與粘度核酸是極性化合物，微溶于水，其鈉易鹽溶于水，而不溶于乙醇、苯酚、氯仿、乙醚等有機溶劑。核酸是高分子化合物，粘度很大。3.紫外吸收核酸有強烈的紫外吸收，其最大吸收峰在260nm處，常以A260表示。第5頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗原理

生物的大部分或幾乎全部的DNA都集中在細胞核或核質體中，人與動物的DNA主要存在于細胞核中，并與蛋白質結合的構成大小不一的染色體。所以蛋白質是DNA提取過程中常見的污染之一，而且蛋白質污染常常影響到以后的DNA操作過程，因此提取過程中要把蛋白質去除。第6頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗原理

本實驗中DNA提取采用的是苯酚/氯仿抽提的方法?；驹砭褪潜椒印⒙确聦Φ鞍踪|有極強的變性作用，而對DNA卻沒有影響。經苯酚/氯仿抽提后，酚/氯仿相與水相完全分層，蛋白質變性而被離心沉降到酚/氯仿相和水相的界面，DNA則留在水相。標本中的脂類雜質溶解于酚/氯仿相，從而與水相分離得以去除。第7頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗原理

此方法提取得到的DNA可能會有RNA雜質，但是RNA極易降解。而且少量的RNA對DNA的后續(xù)操作沒有大的影響，如有必要可以加入不含DNA酶的RNA酶去除RNA的污染。第8頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗步驟1.首先取EDTA抗凝的人外周血2mL,按照1:5～1:10的比例加入去離子水裂解8min，然后1700rpm/min離心，去掉含有紅細胞碎片的上清液，重復裂解一次，留取白細胞沉淀。第9頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗步驟DNA細胞裂解液(pH8.0)：150mmol/LNaCl、10mmol/LTris-HCl、10mmol/LEDTA、0.5%SDSDNA細胞裂解液中SDS的是表面活性劑，主要作用裂解細胞膜、核膜，使核膜里與蛋白質結合的核酸釋放到溶液里面。另外，Tris鹽的作用是使抽提的出來的DNA容易進入水相，減少在蛋白質層的滯留。2.加入0.5mL的DNA細胞裂解液來懸浮白細胞沉淀。第10頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗步驟3.懸浮后的溶液中添加蛋白酶K20μL，65℃水浴0.5h，期間輕緩地倒轉幾次。

4.室溫下，添加0.5mL的苯酚/氯仿/異戊醇混合抽提液，劇烈地震蕩混合10min，然后8000rpm/min離心10分鐘，然后將水相移至新的離心管中。細胞膜裂解以后，細胞中含有的蛋白質和DNA酶等釋放到溶液中，而蛋白酶K具有水解蛋白質和DNA酶的作用，并且在EDTA和SDS存在的條件下仍保持較高的活性。在苯酚/氯仿加入少量的異戊醇，可以減少實驗中氣泡的產生，而且有利于分層，保持分層的穩(wěn)定性。第11頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗步驟5.添加1mL的預冷的無水乙醇到水相中，混勻，8000rpm/min離心3分鐘。加入無水乙醇可以吸收水相中的水分，使得DNA沉淀析出。6.沉淀用70%的預冷乙醇洗滌兩次，然后干燥，最后用50μL去離子水懸浮。70%的冰乙醇可以去除可溶性的多糖、金屬離子等雜質以及殘留的苯酚/氯仿等。第12頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三實驗步驟7.用1%的瓊脂糖電泳鑒定所提取的DNA。8.剩余的DNA貯存在4℃冰箱中,備用。第13頁，共15頁，2023年，2月20日，星期三注意事項一.提取染色體DNA最根本的要求就是保持核酸的完整性。所以操作過程中要注意：1物理因素高分子量的DNA長而彎曲，僅有極微的側向穩(wěn)定性，機械張力和高溫很容易使DNA分子發(fā)生斷裂。因此，實際操作過程中盡量輕緩，盡量避免過度的溶液吹打轉移，以及過高的溫度。2化學因素在過酸的條件下，由于DNA脫嘌呤而導致DNA的不穩(wěn)定，容易在堿基脫落的地方發(fā)生斷裂。因此避免使用過酸的條件。二.步驟3轉移水相時，此時的水相可能比較粘稠，必須非常的小心將水相吸入新離心管并