謝德鑫實(shí)驗(yàn)四 可溶性糖的硅膠G薄層層析

謝德鑫實(shí)驗(yàn)四可溶性糖的硅膠G薄層層析生物技術(shù)111201110414134謝德鑫1目的：1．1掌握薄層層析法的基本原理和方法。1．2掌握可溶性糖分離鑒定的原理和方法。1.3熟悉用蒽酮試劑對(duì)糖的定量測(cè)定方法。2原理：薄層層析(TLC)是吸附劑或支持劑均勻有效地涂布在薄層上進(jìn)行的層析，是一種微量而快速的層析方法。硅膠、氧化鋁和聚酰胺是廣泛采用的吸附劑，硅藻土和纖維素是分配層析中最常用的支持劑，在吸附劑或支持劑中添加了合適的黏合劑后再涂布，可使薄層黏牢在玻璃板(或滌綸片基)這類基底上。硅膠G是一種添加了黏合劑的硅膠粉，約含12％～13％的石膏，它可以把—些物質(zhì)從溶液中吸附于自身的表面上，利用它對(duì)各種物質(zhì)的吸附能力不同，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)展層，使不同的物質(zhì)得以分離，使用顯色劑顯色，得到不同的Rf值。糖在硅膠薄層上的移動(dòng)速度與糖的相對(duì)分子質(zhì)量和羥基數(shù)有關(guān)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)娜軇┱归_(kāi)后，糖在薄板上的移動(dòng)速度是戊糖>己糖>雙糖>三糖。對(duì)已分開(kāi)的斑點(diǎn)顯色，而將與它位置相當(dāng)?shù)牧怼獋€(gè)未顯色的斑點(diǎn)從薄層上與硅膠G一起刮下，用適當(dāng)?shù)娜軇⑻菑墓枘zG上洗脫下來(lái)，就可用糖的定量測(cè)定方法測(cè)出各組分的含糖量。3儀器及材料及試劑3.1儀器：烘箱，吹風(fēng)筒，噴霧器，分光光度計(jì)，微量進(jìn)樣器，層析缸，點(diǎn)樣毛細(xì)管。薄層玻璃板(20cmX20cm)，試管(15mLX24)。3.2材料及試劑：木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：取木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖各100mg，分別用75％乙醇定容至10mL，其質(zhì)量濃度均為10mg／mL。層析溶劑：氯仿：甲醇=60：40（V／V)。苯胺—二苯胺—磷酸顯色劑：1g二苯胺，苯胺1mL和85％磷酸5mL溶于50mL丙酮中。0.1mol／L硼酸溶液(H3BO3)，硅膠G粉。4操作步驟：4.1制備硅膠G薄層板：取硅膠G粉30g，加入75mL0.1mol／L硼酸溶液中，調(diào)勻后鋪于潔凈、平整的玻璃板上，鋪層后的薄板于100℃烘箱中烘干。取出后可貯于干燥器中備用。薄層表面要求平整，厚薄均勻。。4.2糖在硅膠G薄層上的分離：選取制備好的薄層板一塊，在距底邊1．5cm的直線上選4個(gè)點(diǎn)，相互距離2cm。用毛細(xì)管分別點(diǎn)上不同的糖樣品于4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)樣量控制在5～10ug，邊點(diǎn)樣邊吹干，斑點(diǎn)直徑不超過(guò)3mm。待薄層板上樣品自然干燥后，將薄板置于盛有層析溶劑的層析缸中，自下向上展層，當(dāng)展層溶劑到達(dá)離薄板頂端約1cm處時(shí)取出薄板，前沿作一記號(hào)，于60℃烘干2～3h(或空氣中晾干)，揮發(fā)盡溶劑后用噴霧器均勻地噴上顯色劑，于85℃烘烤10min，則各種糖分別顯出不同的顏色。測(cè)量計(jì)算Rf值。5結(jié)果分析：記下各斑點(diǎn)的位置、顏色，計(jì)算Rf值，繪出層析圖譜進(jìn)行分析。各種糖顯色后的呈色如表所示；