華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文答辯

博士論(Lun)文答辯草魚核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-bindingoligomerizationdomain，NOD)基因和γ-干擾素相關(guān)基因(IFN-gammarelatedgene，IFN-γrel)的克隆及其表達(dá)

指導(dǎo)教師：彭克美教授聶品研究員答辯人：陳文欽

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技-動物醫(yī)學(xué)學(xué)院

2010年5月30日第一頁，共四十三頁。答辯內(nèi)(Nei)容五、課程學(xué)習(xí)及文章發(fā)表情況四、創(chuàng)新點及下步研究計劃二、草魚NOD基因三、草魚γ-干擾素相關(guān)基因一、研究

背景匯報

內(nèi)容第二頁，共四十三頁。1.概述以往為人們所熟知的PRRs主要是一些膜結(jié)合蛋白如甘露糖受體、To1l樣受體、CD14和清道夫受體等，主要識別胞外環(huán)境的微生物結(jié)構(gòu)成分。最近的研究發(fā)現(xiàn)，胞漿中也存在著識別細(xì)菌(Jun)和病毒成分的PRRs——核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)蛋白。一、研究背景第三頁，共四十三頁。2.NOD蛋白的組成和結(jié)構(gòu)通過對人類基因數(shù)據(jù)庫同源搜索，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多個成員：NOD1(CARD4)、NOD2(CARD15)、NOD3-NOD5、NALP1-14、IPAF、CIITA、NAIP等。NOD蛋白主要由三個不同的結(jié)構(gòu)域組成：（1）LRR：是富含亮氨酸的重復(fù)序列，位于C端（2）NACHT：位于中央，對于NOD蛋白的寡聚體化和活(Huo)化非常重要。（3）效應(yīng)結(jié)構(gòu)域：位于N端，可以是1個PYD，1個或2個CARD，或者是3個BIR。一、研究背景第四頁，共四十三頁。NOD家族的(De)結(jié)構(gòu)示意圖NALP1NALP2-14NOD1NOD2CARDPYDNACHTNADLRRBIRADFIINDCIITAIPAFNAIPNOD3NOD4XNOD5一、研究背景第五頁，共四十三頁。3.NOD的識別作用已有研究表明，NOD1和NOD2是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌肽聚糖的感受器，能識別細(xì)菌肽聚糖(PGN)的降解產(chǎn)物。NOD1識別的最小結(jié)構(gòu)(Gou)是革蘭氏陰性細(xì)菌的產(chǎn)物內(nèi)消旋二氨基庚二酸(meso-diaminopimelicacid,meso-DAP)；NOD2識別細(xì)菌的最基本結(jié)構(gòu)是PGN的胞壁酰二肽（muramyldipeptide，MDP）。MDP幾乎存在于所有細(xì)菌的PGN中，因此，NOD2既是G+細(xì)菌也是G-細(xì)菌的感受器。

一、研究背景第六頁，共四十三頁。

4.NOD蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在非活化狀態(tài)，NOD1、NOD2的LRR和NACHT結(jié)合保持分子處于折疊狀態(tài)。當(dāng)NOD1和NOD2通過LRR和配體結(jié)合后可以(Yi)打開，通過NACHT自身寡聚，NOD分子的CARD和下游RICK分子的CARD結(jié)構(gòu)域發(fā)生嗜同種結(jié)合，活化RICK。經(jīng)過復(fù)雜的磷酸化，活化NF-κB，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄以及抗菌肽的合成。一、研究背景第七頁，共四十三頁。NODs介(Jie)導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路圖第八頁，共四十三頁。

5.NOD蛋白的生物學(xué)功能

NOD蛋白主要的生物學(xué)功能是加強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)探測微生物感染的能力，產(chǎn)生IL-1β等促炎因子，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。近來的研究發(fā)現(xiàn)NOD蛋白除(Chu)了識別細(xì)菌產(chǎn)物外，還可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、直接參與細(xì)菌感染的控制?，F(xiàn)在也有最新報道，證明NOD蛋白也在抗病毒免疫中起著重要作用。一、研究背景第九頁，共四十三頁。6.選題的目的與意義

盡管對哺乳動物胞內(nèi)模式識(Shi)別受體在參與對細(xì)菌的識(Shi)別、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用等方面進(jìn)行了深入的研究，但國內(nèi)外對魚類NOD基因的研究僅有2篇報道。迄今為止，對魚類NOD基因的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的特征以及是否具有類似于哺乳動物的功能還是不清楚的。本論文擬通過對草魚NOD1和NOD2基因的克隆以及表達(dá)分析，旨在揭示魚類NOD基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)特征。同時該研究為進(jìn)一步研究NODs基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

一、研究背景第十頁，共四十三頁。二(Er)、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析1.gcNODs基因的分子特點1.1gcNOD1:

cDNA包含3215bp，ORF區(qū)域為2813bp，大約編碼937個氨基酸,5′-UTR為350bp，3′-UTR為52bp。C端的LRR結(jié)構(gòu)域，位置在769-791、825-851；N端有一個CARD，結(jié)構(gòu)域在11-73；NOD1的NACHT結(jié)構(gòu)域在186-359。第十一頁，共四十三頁。1.2gcNOD2:cDNA全長3130bp，編碼982個氨基酸；ORF為2949bp，編碼982氨基酸，5′-UTR為81bp，3′-UTR為103bp，C端LRR有7個串聯(lián)(Lian)結(jié)構(gòu)域；N端有兩個CARD，結(jié)構(gòu)域在27-81、111-200；中間NACHT結(jié)構(gòu)域在271-441。二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析第十二頁，共四十三頁。二、gcNODs基因(Yin)的克隆與表達(dá)分析草魚NOD1草魚NOD2草魚NODs基因的結(jié)構(gòu)示意圖NACHTCARDLeucineRichRepeat第十三頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的(De)克隆與表達(dá)分析2.gcNODs基因的基因組結(jié)構(gòu)974968171523241319996471895524175180484848484848484124grasscarpNOD11735611271765848484848484319266147108878919090511grasscarpNOD2草魚NOD1基因組全長9kb,由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成草魚NOD2基因組全長5kb,由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成第十四頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的(De)克隆與表達(dá)分析3.gcNODs基因的內(nèi)含子相位12345678910gcNOD10122222222zfNOD10122222222hNOD10122222222gcNOD2012222222zfNOD2012222222hNOD2012222222表1.草魚、斑馬魚以及人NODs基因內(nèi)含子相位第十五頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的克隆與表(Biao)達(dá)分析4.

gcNODs基因與其他物種NODs基因的氨基酸相同/相似性比較Full-lengthCARDsNACHTLRRszebrafishNOD181.3/86.773.1/75.692.5/95.488.2/94.9humanNOD150.2/70.938.4/54.758.0/73.057.9/78.5pigNOD151.1/71.534.9/52.358.6/74.757.9/76.9mouseNOD150.4/70.939.5/52.358.0/76.454.9/74.4Full-lengthCARDsNACHTLRRszebrafishNOD283.8/92.068.5/77.690.1/95.982.8/91.8humanNOD245.6/62.629.6/46.557.3/73.154.1/67.8pigNOD246.8/65.227.6/47.456.7/73.752.6/69.3mouseNOD247.0/64.728.5/48.459.6/74.353.0/67.0第十六頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的(De)克隆與表達(dá)分析5.

gcNODs基因的分子進(jìn)化樹第十七頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的克隆與表(Biao)達(dá)分析6.

gcNODs基因在不同組織中的組成性表達(dá)第十八頁，共四十三頁。二(Er)、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分析7.

gcNODs基因在肽聚糖刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá)*****第十九頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分(Fen)析*****8.

gcNODs基因在脂多糖刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá)******第二十頁，共四十三頁。二、gcNODs基(Ji)因的克隆與表達(dá)分析******9.

gcNODs基因在PolyI:C刺激下的誘導(dǎo)型表達(dá)******第二十一頁，共四十三頁。二、gcNODs基因(Yin)的克隆與表達(dá)分析10.

gcNODs基因在呼腸孤病毒感染下的誘導(dǎo)型表達(dá)****************第二十二頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)分(Fen)析11.

gcNOD1基因重組蛋白的表達(dá)與純化97.466.243.031.020.114.4第二十三頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的克隆與(Yu)表達(dá)分析11.

gcNOD1基因重組蛋白的表達(dá)與純化M1234567897.466.243.031.020.1第二十四頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的克隆(Long)與表達(dá)分析12.

gcNOD1蛋白的免疫組化ABCDEF第二十五頁，共四十三頁。二、gcNODs基因(Yin)的克隆與表達(dá)分析13.小結(jié)（1）首次從魚類中克隆了NOD1和NOD2基因，氨基酸的排列、基因組結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子相位的分析都顯示了NOD1和NOD2在進(jìn)化上具有很強(qiáng)的保守性；（2）熒光定量分析顯示草魚的NOD1和NOD2基因呈廣泛的組成性表達(dá)分布，在所檢測的組織中都可以檢測到表達(dá)；第二十六頁，共四十三頁。二、gcNODs基因的克隆與表達(dá)(Da)分析（3）來自革蘭氏陽性菌的PGN對草魚NOD1的表達(dá)在大多數(shù)組織中沒有顯著的作用；（4）在LPS刺激下，gcNOD1的誘導(dǎo)表達(dá)特征與gcNOD2相似；（5）polyI:C和病毒感染也能誘導(dǎo)gcNOD1和gcNOD2的表達(dá)。第二十七頁，共四十三頁。三、gcIFN-γrel基(Ji)因的克隆與表達(dá)分析1.gcIFN-γrel基因的分子特點

IFN-γrel基因的cDNA包含861bp，其中5-UTR長39bp，ORF長504bp編碼167個氨基酸，3-UTR長316bp。3-UTR富含AT（75.2%），一個潛在的多腺苷酸加尾信號（AATAAA)位于poly[A]尾上游13bp。第二十八頁，共四十三頁。三、gcIFN-γrel基因的克隆與(Yu)表達(dá)分析AAATTCGCTTGGTTCACAGCACCAAAACACAAACACAAAGAATGGATTCTTGGCTCAACAMDSWLNTGATGCTGCTGTGTGGACTTCTGTTAATAGCATCTCTTCAGACAACCAACGCTTTCAGATMMLLCGLLLIASLQTTNAFRTTCGACGGTCCAAAAGCGAGATGACCCATTTGGAGACAAATATCCACTCTCTGCAAGAACFRRSKSEMTHLETNIHSLQEATTATgtaagtgatgtctactatcatgaacttcagcagggggtttgaaagcaactcttgtHYctgtgttaacaagatgaatcacttcaagtcctactcatatctgtatgttatagtttggtcttgcggctaatattagcaagaagagacctattgcacaataaatttcacgaaactttgttcttagattaggagttaagattcaccagagatgcacattcattcataacgtttgctgttttttgcccgctttctttagAAAACACGTGGCACAGAATGGGTTTCAAAGTCTGTTTTTGTTCCKTRGTEWVSKSVFVPTCATCTGAACCAGCTGAATgtaagtttttactgtgcaaaatgctaaaatattaaaatgcaHLNQLNactgaatgatatatatgcctctatatatgtatcatgctaataatacttgtttctcttagTCCAAGGCTTCCTGCACTTGTCAGGCGCTGTTGCTTGAAAGAATGCTGAACATCTACGAAGSKASCTCQALLLERMLNIYEAACTTTTCCAAGACATGAAGTCTGAGCATAAAGAAGGGAGAAAAGATCTAGACCATCTAAELFQDMKSEHKEGRKDLDHLTGGATGAGGTGAAAAAGCTGAGGGGAAATTATAAGGAAGAACATAAAGTATGGAAAGAGCMDEVKKLRGNYKEEHKVWKETTCAGGAAATGAACTCAGTCAAGgtaaacattaagagaaagtcctgtcttcattgtgaatLQEMNSVKgtgtacattttgagttattgaattgctgtttatcatatgatatcaggtcaggtgatataatatatgatatggtactgtatctaatacaaatatttgtcctcactctcacaagGTGAAAAAVKTGGAACAATCCGAGGAGGAGCATTAAATGACTTTCTCATGGTGTTTGATCGGGCCTCTACNGTIRGGALNDFLMVFDRAS

AGAAAAACACAAAAAGGTTCAATGAGAAGATCCAAAAGTCATGTCTTTCATTTAGTAAACTEKHKKVQ*TTGCGCTTTGTTATTGTGTTAGCCTATTTATTTATAAATTATATGGAAATAATTATTTATTTTTAACTTTATAATGTACTCTACTACACCATCCATAACTTATAATCTAACTTATTCTCATCACAAGTGTGTTTGCATCATTTACAGTGTACAGAAACGATGAACGTTGATTTCTAACTGGATTTGCTTGAAATATTCTGTGAGCTTCACTGGCTAAATGTTTAATTACAATAAATTAATTTTGCATTAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA

草魚γ-干擾素相關(guān)基因的cDNA與基因組序列第二十九頁，共四十三頁。三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達(dá)(Da)分析2.gcIFN-γrel基因與其他物種γ-干擾素與γ-干擾素相關(guān)基因同源性比較SpeciesAminoacididentity/similarity(%)CatfishIFN-γrel37.8/63.2ZebrafishIFN-γrel62.9/77.6CarpIFN-γrel50.0/71.9ZebrafishIFN-γ19.8/44.3GoldfishIFN-γ21.7/44CodIFN-γ20.6/44.3CatfishIFN-γ21.8/48.3CarpIFN-γ20.7/41.4FuguIFN-γ17.7/40.7TroutIFN-γ119.4/48.9TroutIFN-γ221.5/50.6SalmonIFN-γ21.9/52.8第三十頁，共四十三頁。三、gcIFN-γrel基因的克隆與表(Biao)達(dá)分析3.gcIFN-γrel基因與其他硬骨魚類γ-干擾素與γ-干擾素相關(guān)基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系第三十一頁，共四十三頁。三、gcIFN-γrel基因的克隆與(Yu)表達(dá)分析4.gcIFN-γrel基因的組織表達(dá)第三十二頁，共四十三頁。三、gcIFN-γrel基因的克隆(Long)與表達(dá)分析5.gcIFN-γrel基因在脂多糖和PolyI:C刺激下的誘導(dǎo)性表達(dá)****LPS****polyI:C第三十三頁，共四十三頁。三、gcIFN-γrel基因的克隆(Long)與表達(dá)分析6.

PGN的刺激對草魚IFN-γrel、NOD1和NOD2表達(dá)的影響第三十四頁，共四十三頁。三、gcIFN-γrel基因的(De)克隆與表達(dá)分析7.

gcIFN-γrel基因在呼腸孤病毒感染下的誘導(dǎo)型表達(dá)*******第三十五頁，共四十三頁。三(San)、gcIFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分析8.小結(jié)(1)序列分析顯示本研究所克隆的gcIFN-γrel基因是一個

與斑馬魚、鯰魚和鯉魚中IFN-γrel基因同源的基因，而不是那個早已存在的IFN-γ基因；(2)與哺乳類和鮭鱒的IFN-γ不同的是，從20條不同來源的草魚的序列分析顯示，gcIFN-γrel在它的內(nèi)含子中缺乏多態(tài)性微衛(wèi)星序列；第三十六頁，共四十三頁。三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達(dá)分(Fen)析(3)gcIFN-γrel呈廣泛的組成性表達(dá)；(4)聚肌胞甘酸(polyI:C)，一種模擬病毒雙鏈RNA而合成的dsRNA，能上調(diào)gcIFN-γrel基因的表達(dá);(5)在所分析的四個組織中，gcIFN-γrel的表達(dá)規(guī)律與gcNOD2相一致；推測IFN-γ和IFN-γrel被細(xì)菌的產(chǎn)物PGN所激活可能是通過NOD2依賴的方式。第三十七頁，共四十三頁。四、創(chuàng)新點及下步研(Yan)究計劃1.主要創(chuàng)新點

（1）首次從草魚中克隆了胞內(nèi)識別細(xì)菌的模式識別受體NOD1和NOD2基因的cDNA全長和基因組全長；（2）對草魚胞內(nèi)模式識別受體NOD1和NOD2從mRNA水平、蛋白水平及細(xì)胞水平進(jìn)行了表達(dá)或定位分析；同時，首次研究了病毒的感染對細(xì)菌模式識別受體NOD1和NOD2基因表達(dá)的影響；（3）克隆了草魚IFN-γ相關(guān)基因的cDNA全長和基因組全長，并對該基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究；首次提出了草魚IFN-γ相關(guān)基因與NOD樣模式識別受體在發(fā)揮功能上存在相關(guān)性。第三十八頁，共四十三頁。2.下步研究計劃

（1）研究NOD樣模式識別受體對細(xì)菌成分的識別以及在病(Bing)毒