微生物檢驗基本要求

微生物檢驗基本要求內(nèi)容微生物學基本知識微生物學檢驗技術(shù)微生物學實驗室的質(zhì)量保證微生物學實驗室的生物安全微生物基本知識微生物的概念微生物的種類微生物的特點微生物學的主要分支學科微生物基本知識◆

微生物的概念

是一群形體微小、結(jié)構(gòu)簡單的低等生物的統(tǒng)稱。需借助光鏡或顯微鏡測量單位為微米或納米微生物基本知識微生物的種類§真核細胞型：(eucaryotae)

真菌（霉菌、酵母、蕈類)、藻類§原核細胞型：

(procaryotae)

細菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次氏體、螺旋體§

非細胞類：（nocell)

病毒、類病毒、朊病毒等微生物的相對大小可見范圍肉眼光學顯微鏡電鏡真核細胞型原核細胞型病毒◆微生物的特點體積小，面積大吸收多，轉(zhuǎn)化快生長旺，繁殖快適應強，變異頻分布廣，種類多微生物基本知識

體積小面積大微生物的個體極其微小必須借助顯微鏡放大幾倍、幾百倍、上千倍，乃至數(shù)萬倍才能看清。表示微生物大小的單位是微米（1米＝106微米）或納米（1米＝109納米）。如：桿菌的寬度是0.5微米，80個桿菌“肩并肩”地排列成橫隊，也只有一根頭發(fā)絲的寬度。桿菌的長度約2微米，故1500個桿菌頭尾銜接起來僅有一顆芝麻長。吸收多轉(zhuǎn)化快如大腸桿菌在合適條件下，每小時可以消耗相當于自身重量2000倍的糖而人要完成這樣一個規(guī)模則需要40年之久生長旺繁殖快大腸桿菌(E.coli)§

37℃培養(yǎng)在牛奶中，12.5min即可分裂一次；一般培養(yǎng)液的菌濃度為108-109個/ml§如各方面的條件都合適，大腸桿菌每12.5-20（有說20-30）分鐘分裂一次按20分鐘來算，則1晝夜分裂72次，那么1個菌體就會產(chǎn)生272（即4722366500萬億）個，重達4722噸

適應強變異頻耐熱：在250℃-300℃的高溫條件下正常生長

耐寒：多數(shù)細菌能耐0℃到－196℃的低溫

耐鹽：嗜鹽細菌甚至能在飽和鹽水中正常生活

耐干：產(chǎn)芽孢細菌和真菌孢子在干燥條件下能保藏幾十年、幾百年甚至上千年

耐酸耐堿耐壓:

突變頻率一般為10-5-10-10

分布廣種類多§在地球上幾乎無處不有，無孔不入

85公里的高空、11公里深的海底、2000米深的地層、近100℃（甚至300℃）的溫泉、零下250℃的環(huán)境下，均有微生物存在§微生物種類繁多

迄今為止，微生物約有10萬種，估計目前已知的種只占地球上實際存在的微生物總數(shù)的20%微生物學的主要分支學科微生物學檢驗技術(shù)一、微生物學檢驗的目的

◆臨床微生物檢驗：為診斷提供病原學依據(jù)為治療提供參考用藥的信息為醫(yī)院感染提供病原微生物及其耐藥性動態(tài)信息改進或更新臨床微生物學檢驗的方法

◆

衛(wèi)生微生物檢驗：判斷水、空氣、食品、日用品以及各類公共場所的衛(wèi)生狀況

指標性微生物

指標性微生物

指標菌可以歸納為以下三種類型：◆一般衛(wèi)生狀況指標菌最常用的是菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)意義：評價被檢樣品的一般衛(wèi)生質(zhì)量、污染程度以及安全性◆糞便污染指標菌主要指大腸菌群，其他還有腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、噬菌體以及脊髓灰質(zhì)炎病毒等意義：標志著檢品受過人、禽畜糞便的污染，同時也可表明有腸道致病菌存在的可能指標性微生物◆致病菌（控制菌）包括某些特定環(huán)境不能檢出的菌類食品、化妝品或藥品等樣品中規(guī)定一些不得檢出的致病菌例如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、破傷風芽胞桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、空腸彎曲菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟樣芽胞桿菌等食品衛(wèi)生微生物檢驗一般衛(wèi)生狀況指標菌檢驗

菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌糞便污染指標菌檢驗

大腸菌群、類大腸菌群控制菌檢驗沙門氏菌、志賀氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、空腸彎曲菌、肉毒梭菌及肉毒毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌、椰毒假單胞菌酵米面亞種、單核細胞增生李斯特氏菌、變形桿菌

化妝品衛(wèi)生微生物檢驗一般衛(wèi)生狀況指標菌檢驗

菌落總數(shù)檢測霉菌和酵母菌檢測糞便污染指標菌檢驗糞大腸菌群檢驗控制菌檢驗綠膿桿菌檢驗金黃色葡萄球菌檢驗微生物學檢驗技術(shù)三、標本采集與處理不同的樣品采集、保存、運送的要求都是不同的標本采集原則§無菌操作

無菌采集、采樣用具、容器必須要經(jīng)過滅菌處理

早期安全足量§采樣前、后都應及時做好標記采集的樣品要有代表性§采樣后應及時將樣品送到微生物檢驗室標本的運送標本采集后最好及時運送到實驗室若不能，應儲存在合適的一定環(huán)境條件

細菌:病毒:感染性樣本應注意安全防護運送過程防止泄漏和破碎微生物檢驗技術(shù)四、微生物學檢查形態(tài)學檢查人工培養(yǎng):接種分離純化培養(yǎng)技術(shù)分離鑒定及增菌培養(yǎng)毒力鑒定及抗菌藥物敏感試驗生化試驗免疫檢測技術(shù)：抗原檢測抗體檢測核酸檢測技術(shù)：核酸分子雜交PCR

動物試驗

自動化技術(shù)形態(tài)學檢查

直接鏡檢顯微鏡觀察：光學顯微鏡電鏡人工培養(yǎng)分離培養(yǎng)與鑒定：

革蘭氏染色陰性成魚群狀排列的弧菌

霍亂弧菌接種技術(shù)分離純化技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)霍亂分離培養(yǎng)分離用的培養(yǎng)基有強、弱2種選擇培養(yǎng)基弱選擇培養(yǎng)基：堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂強選擇培養(yǎng)基：常用的有慶大霉素瓊脂、4號瓊脂和TCBS瓊脂等現(xiàn)多采用堿性蛋白胨水增菌，再用強選擇培養(yǎng)基進行分離生化試驗霍亂紅試驗

陽性霍亂弧菌氧化酶試驗

粘絲試驗靛基質(zhì)試驗免疫檢測技術(shù)抗血清凝集技術(shù)乳膠凝集實驗熒光抗體檢測技術(shù)協(xié)同凝集試驗（COA）酶聯(lián)免疫測試技術(shù)微生物檢驗技術(shù)

霍亂檢驗程序分子生物學檢測核酸探針雜交技術(shù)PCR技術(shù):PCR&RT-PCRReal-timePCRQβ復制酶法連續(xù)擴增反應法（Lar）轉(zhuǎn)錄放大系統(tǒng)（TAS/3SR/NASBATM）放大信號檢測法

……分子生物學技術(shù)在病原菌檢測上的應用

細菌:沙門氏菌李斯特桿菌葡萄球菌假單胞菌屬大腸桿菌志賀氏菌耶爾森氏菌彎曲桿菌弧菌病毒:流感&禽流感肝炎SARSNorovirusAdenovirusEnterovirusDenguevirusRinovirus……

自動化技術(shù)微生物自動鑒定商品名稱分析手段

生產(chǎn)商AutomicrobicBiochemicaltestsBioMerieuxVitek,Hazelwood,MOBactometerConductanceBioMerieuxVitek,Hazelwood,MOATBCarbonassimilationBioMerieuxVitekHazelwood,MOVIDASAutomatedEIAcBioMerieuxVitekHazelwood,MOMISFattyacidprofileMicrobialIDNewark,DEMaalthusdConductanceRadiometerAmericaWestlake,OHSensititreFluorogenicdnzymeReactionsRadiometerAmericaWestlake,OHBiologCarbonutilizationBiologHayward,CAWalkAwayBiochemicalBaxterDiagnosticsW.Sacramento,CAAutoSCANBiochemicalBaxterDiagnosticsW.Sacramento,CAALADINBiochemicalAnalytabProductsPlainview,NYUniSceptBiochemicalAnalytabProductsPlainview,NYAutoSceptorBiochemicalBectonDickinsonCockeysville,MD微生物檢驗中的質(zhì)量保證

及實驗室管理微生物實驗室質(zhì)量保證的措施室內(nèi)質(zhì)控室間質(zhì)評微生物實驗室質(zhì)量保證的目標

可靠性可重復性實際效果及時性過程控制文件微生物學檢驗過程試驗過程控制樣品采集樣品標記樣品運輸培養(yǎng)基染料儀器樣品接收和登記檢驗分析研究準備相關(guān)檢驗報告試劑熟練程度微生物檢驗的質(zhì)量控制試驗前試驗中試驗后正確的病人正確的取樣正確的條件適當?shù)膬x器合適的試驗材料正確的方法正確的資料合適的時間微生物培養(yǎng)基的質(zhì)量控制檢測所有培養(yǎng)基的性能自行配制：所有批次商業(yè)制備：只檢測新批號培養(yǎng)基質(zhì)量要求微生物污染生長特性生長率選擇性生理生化特性選擇性和特異性外觀、色澤和均一性瓊脂凝膠的硬度水份含量pH緩沖能力

對培養(yǎng)基進行質(zhì)量控制的主要內(nèi)容培養(yǎng)基的質(zhì)量控制檢查

pH，無菌性，支持生長的能力，培養(yǎng)基的選擇或抑制特性(目標微生物生長，非目標微生物不生長)，生化反應，瓊脂凝膠的硬度，水份含量，外觀和色澤的均一性檢測頻率檢測各個批次或各批號將結(jié)果記錄在培養(yǎng)基質(zhì)量控制表格

含人血的血平板不適于微生物檢測配制培養(yǎng)基時的質(zhì)量控制

嚴格按培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)基配制操作程序進行配制

每批培養(yǎng)基均應有配制記錄如名稱、配制量（各種成分用量）、配制者、配制日期、有效期以及性能和無菌試驗無菌實驗:配制培養(yǎng)基時的質(zhì)量控制性能試驗培養(yǎng)基的儲存應放在冷暗、干燥處

含有血液和其他有機添加劑抗菌素的培養(yǎng)基要儲存在冰箱里培養(yǎng)基的貯存

培養(yǎng)基種類保存條件保存時間三角瓶（棉塞）培養(yǎng)基

室溫一周三角瓶（螺旋蓋）培養(yǎng)基室溫三周平板培養(yǎng)基室溫當天平板培養(yǎng)基（裝袋密封）4℃

一周培養(yǎng)基使用中應避免的問題污染了的培養(yǎng)基已失水的培養(yǎng)基使用過期的培養(yǎng)基培養(yǎng)基配制記錄的快速提示

實驗室制備的所有培養(yǎng)基都必須記錄：

配制日期和配制人培養(yǎng)名稱，批號，培養(yǎng)基粉名稱所配平板、試管、瓶的數(shù)量分裝的批號顏色、一致性、外表用于質(zhì)量控制的平板數(shù)量24/48小時無菌實驗生長實驗培養(yǎng)基的pH我國培養(yǎng)基相關(guān)標準1.YYT0557-2005營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2.YYT0578-2005沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基3.SNT1538.1-2005培養(yǎng)基制定指南第一部分：實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則4.SNT1538.1-2007培養(yǎng)基制定指南第2部分:培養(yǎng)基性能測試實用指南M-H瓊脂板的質(zhì)量控制無菌（每批平板隨機選擇一個樣本作無菌試驗，培養(yǎng)48-72h）厚度：4mm，且厚度必須均勻（9cm平板傾注瓊脂量25-30ml；16cm平板需60ml左右）調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4（pH過低---氨基糖苷類，大環(huán)內(nèi)酯類失效，而青霉素活力增強。）胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的影響：含過量的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的培養(yǎng)基可能逆轉(zhuǎn)磺胺類甲氧芐氨嘧啶的抑菌效應，使抑菌圈模糊變小，甚至消失。用TMP-SMZ紙片可測定培養(yǎng)基中的磺胺嘧啶得含量，當抑菌圈清晰、直徑≥20mm，說明該培養(yǎng)及合格二價陽離子含量變化的影響Ca++、Mg++：影響氨基糖苷類、四環(huán)素的抑菌圈Zn++：影響碳頭孢烯類平板表面應干燥：使用前干燥平板平板有效期為5天使用含血的M-H培養(yǎng)基特別注意項M-H瓊脂板的質(zhì)量控制診斷血清的質(zhì)量控制注明收到的日期，如為凍干制品，還應注明配成水溶液的日期使用前檢查外觀應清澈，如出現(xiàn)混濁則表示已被雜菌污染使用時應注意各種診斷血清的有效期和效價每月用標準菌株試驗其敏感性和特異性

染色液的質(zhì)量控制染色液配制后，必須用適當?shù)臉藴示曜麝栃约瓣幮詫φ赵囼炘谑褂闷趦?nèi)每隔一段時間進行監(jiān)測其監(jiān)控頻率隨染色液的穩(wěn)定性和使用頻率而定

染液的質(zhì)量控制革蘭氏染料質(zhì)量控制使用革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌株析出晶體檢測污染細菌檢測定期參加能力驗證進行實驗室內(nèi)比對

其他染料抗酸性染色真菌的KOH染色吖啶黃腸道寄生蟲染色瘧疾涂片染色

染料和試劑準備標簽內(nèi)容名稱濃度制備日期使用時間過期時間/保質(zhì)期制備者

質(zhì)量控制菌株什么是質(zhì)控菌株？在染液和培養(yǎng)基中有預期反應的已知菌株菌株的來源？ATCCAmericanTypeCultureCollection美國菌種保藏中心NTCC NationalTypeCultureCollection(UK)國際菌種保藏中心(英國)CIPPasteurInstituteCollection(France)巴斯德保藏中心(法國）質(zhì)控菌株如何使用？確保培養(yǎng)基，試劑和用品有預期的效能

設置陰性和陽性對照株

質(zhì)控菌株的保存儲備檢測所有培養(yǎng)基和實驗系統(tǒng)的質(zhì)控菌株

例如：大腸桿菌(ATCC#25922)–麥康凱培養(yǎng)基或EMB，藥敏試驗金黃色葡萄球菌(ATCC#25923)–血瓊脂，甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基，藥敏試驗淋病奈瑟氏菌(ATCC#49226）–巧克力培養(yǎng)基，T-M培養(yǎng)基所需要的其他質(zhì)控菌株質(zhì)控菌株的使用在每批培養(yǎng)基及新的藥敏片使用時同時做質(zhì)控，標準菌株的抑菌環(huán)或MIC值在標準范圍內(nèi)E.coliATCC25922S.aureusATCC25923P.aeruginosaATCC27853根據(jù)抑菌環(huán)直徑分析變化根據(jù)你的檢測使用不同的標準株（ATCC,IP或其他）藥敏試驗常用質(zhì)控菌株常規(guī)藥敏標準菌株大腸埃希菌 ATCC25922金黃色葡萄球菌 ATCC25923銅綠假單胞菌 ATCC27853流感嗜血桿菌 ATCC49247 ATCC49766肺炎鏈球菌 ATCC49619β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）測定標準菌株

肺炎克雷伯菌ATCC700603，大腸埃希菌ATCC35218培養(yǎng)基磺胺嘧啶測定標準菌株糞腸球菌ATCC29212儀器設備-微生物學監(jiān)控溫度培養(yǎng)箱冰箱冷凍柜 進行功能檢測移液器高壓鍋酸度計秤重保存記錄顯微鏡保持鏡頭清潔保證至少一個油鏡(X100)使用轉(zhuǎn)扭調(diào)節(jié)鏡頭非油鏡不要浸入油中

移動樣本時不能使樣本高于鏡頭確保照明系統(tǒng)

消毒與滅菌培養(yǎng)基試劑材料廢物滅菌（Sterilization）：殺滅物體上所有的微生物（包括病原體和非病原體的繁殖體和芽胞）的方法消毒(Disinfection）：殺滅病原微生物的方法兩階段滅菌控制過程控制化學指示劑生物指示劑滅菌產(chǎn)品控制生長實驗(生物驗證）滅菌指示物高壓濕熱滅菌指示膠帶（121℃，132℃）干熱滅菌指示膠帶環(huán)氧乙烷滅菌指示膠帶γ射線滅菌指示標簽生物指示劑滅菌指示物化學指示物

僅指示滅菌溫度，但不涉及滅菌時間和壓力生物學指示物指示滅菌需要的溫度、時間和壓力注意：指示物在以下情況下不保證滅菌的效果：高壓鍋內(nèi)東西放的過多；培養(yǎng)液體積過大；滅菌后的生物驗證試驗十分重要藥敏實驗為選擇合適的抗生素進行治療提供依據(jù)監(jiān)測耐藥趨勢體外藥敏實驗無明顯的生長有明顯的生長敏感不敏感藥物目標菌肉湯稀釋法藥敏試驗中可能出現(xiàn)的錯誤培養(yǎng)基不好——太陳舊，厚度，pH過期或保存不當?shù)乃幤?/p>

活性降低錯誤的接種——

細菌接種量太多或太少錯誤的孵育——

溫度太熱/太冷，時間太長/太短錯誤的儀器設備——

讀錯區(qū)帶錯誤的解釋——

曲解區(qū)帶

藥敏檢測

孵育條件、溫度和時間腸桿菌科：35℃±2℃，空氣，16-18h葡萄球菌屬：33-35℃,空氣，16-18h，苯唑西林和萬古霉素需24h觀察腸球菌屬：35℃±2℃，空氣，16-18h， 萬古霉素需24h觀察嗜血桿菌屬：35℃±2℃，5%CO216-18h鏈球菌屬：35℃±2℃，5%CO2，

20-24h藥敏實驗的質(zhì)量控制質(zhì)控菌株必須有可靠的來源

使用特定的質(zhì)控菌株去檢測不同的藥物-目標菌組合

按照廠家的說明儲存抗生素試劑

藥敏試驗質(zhì)量控制培養(yǎng)基抗生素菌液培養(yǎng)箱菌種藥片M-H培養(yǎng)基保存溫度McFarland0.5(108bacteria/ml)溫度氣壓 保存條件，使用要求保存條件（溫度、干燥）ATCC標準株，4mm厚，pH-20oC以下分光光度計檢測標準的溫度計氣壓計標準菌株、待測菌株紙片分配器優(yōu)點實用，快速

提高了可重復性

缺點增加污染的機會降低了人員判斷技能等保存使用之后，放回冷藏箱，朝上放置。

操作者的熟練度常規(guī)的能力驗證

室內(nèi)實驗程序完全按照SOP進行實驗操作質(zhì)量控制：免疫學-血清學針對抗原-抗體檢測試驗每天至少有一次試驗帶上陽性和陰性對照。包括弱陽性對照

所有孵箱，搖床和離心機的功能監(jiān)控

質(zhì)量控制：分子診斷樣品采集，運輸和處理保證所有上述過程中核酸的完整性

控制污染在無DNA區(qū)域，配制試劑后進入樣本處理區(qū)，再進入擴增和檢測區(qū)；并保持這一單向流程

陽性和陰性對照參考：感染性疾病的分子診斷方法

目的：

存活，不丟失，不污染

防止優(yōu)良性狀喪失

隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種

原理：

選用優(yōu)良的純種（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等）

創(chuàng)造降低微生物代謝活動強度

生長繁殖受抑制

難以發(fā)生突變的環(huán)境條件

其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)以及添加保護劑等

菌種保藏：

菌

連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）移種

種

生活態(tài)

傳代培養(yǎng)保藏法

連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種

保

固體斜面

藏

濕法半固體瓊脂柱

方

休眠態(tài)

液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液）

法

干法藏在玻璃管內(nèi)

吸附在合適的載體上菌種保藏的方法干法保藏菌種的方法

滴入小試管（在放入大試管干燥器中）藏在玻璃管內(nèi)封入安培瓶菌液直接真空干燥法（L-干燥法）冷凍真空干燥法細粒狀載體（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球塊狀載體（硅膠、瓷球）合適的載體有機基質(zhì)（曲料、麥粒）

薄片狀載體濾紙片明膠小片（滴在蠟紙板上干燥而成）血清蛋白小片（乙烯薄膜）

幾種常用菌種保藏方法的比較方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評價

冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固體）石蠟油封藏法*沙土保藏法冷凍干燥法低溫低溫低溫、缺氧干燥、無營養(yǎng)干燥、無氧、低溫、有保護劑各大類細菌、酵母菌各大類**產(chǎn)孢子微生物各大類3-6月6-12月1-2年1-10年5-15年以上簡便簡便簡便簡便有效簡便有效菌種保藏機構(gòu)的任務：廣泛收集科研和生產(chǎn)菌種、菌株，并加以妥善保管，使之達到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。菌種保藏機構(gòu)：

中國微生物菌種保藏委員會(CCCCM)

美國的典型菌種保藏中心(ATCC)

英國國家典型菌種保藏所（NCTC）法國里昂巴斯德研究所（IPL）國內(nèi)外菌種保藏機構(gòu)：微生物檢驗與生物安全實驗室安全防護感染性廢棄物的處理實驗室分級依據(jù)實驗室分級處理對象危險等級BSL-1ABSL-1對人體和環(huán)境危害較低，不會引發(fā)健康成人疾?、窦塀SL-2ABSL-2對人體和環(huán)境有中等危害或具有潛在危險的致病因子Ⅱ級BSL-3ABSL-3主要通過呼吸途徑使人傳染上嚴重的甚至是致命疾病的致病因子。通常有預防治療措施Ⅲ級BSL-4ABSL-4對人體有高度危險性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明的微生物。尚無預防治療措施Ⅳ級微生物危害程度分級

（國際分級標準）危險等級I

（低個體危害，低群體危害）不會導致健康工作者和動物致病的細菌、真菌、病毒和寄生蟲等生物因子。危險等級Ⅱ

(中等個體危害，有限群體危害)能引起人或動物發(fā)病，但一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會引起嚴重危害的病原體。實驗室感染不導致嚴重疾病，具備有效治療和預防措施，并且傳播風險有限。微生物危害程度分級

（國際分級標準）危險等級III

（高個體危害，低群體害）能引起人類或動物嚴重疾病，或造成嚴重經(jīng)濟損失，但通常不能因偶然接觸而在個體間傳播，或能使用抗生素、抗寄生蟲藥治療的病原體。危險等級Ⅳ

(高個體危害，高群體危害)能引起人類或動物非常嚴重的疾病，一般不能治愈，容易直接或間接或因偶然接觸在人與人，或動物與人，或人與動物，或動物與動物間傳播的病原體。病原生物的危險等級分布種類危害等級Ⅳ危害等級III危害等級Ⅱ危害等級I病毒185114219