孔雀石綠的檢測(cè)方法O

孔雀石綠的分析孔雀石綠：化學(xué)名為四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式C23H25ClN2，又名堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠、維多利亞綠或中國綠,屬三苯甲烷類,用于制陶、紡織、皮革、食品著色劑和細(xì)胞染劑,目前多用于抗真菌感染和殺滅寄生蟲,在水產(chǎn)領(lǐng)域一般用于魚類防治水霉病,爛鰓病以及寄生蟲等,由于其性價(jià)比高,曾一度在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用。但各種毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,MG具有高毒、高殘留、“三致”等毒副作用,其在水產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用已為世界各國所禁止。近年來發(fā)現(xiàn)孔雀石綠(MG)特別是其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠(LMG)在水產(chǎn)動(dòng)物體有明顯的蓄積殘留現(xiàn)象,而其化學(xué)官能團(tuán)三苯甲烷是一類致癌物質(zhì)

無色孔雀石綠(LMG)的結(jié)構(gòu)式:孔雀石綠(MG)的結(jié)構(gòu)式：孔雀石綠的檢測(cè)方法目前孔雀石綠的檢測(cè)以理化檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法為主。一、理化檢測(cè)法薄層層析法分光光度法氣相色譜法(GC)高效液相色譜法(HPLC)液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)檢測(cè)法(LC-MS)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)二、免疫學(xué)檢測(cè)主要用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法。國內(nèi)孔雀石綠檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

理化檢測(cè)方法適用于專業(yè)檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室使用，,但難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層樣品初篩的要求。近年來發(fā)展迅速的免疫分析法(IA)集免疫反應(yīng)、有機(jī)合成、酶催化等先進(jìn)技術(shù)于一身,具備快速準(zhǔn)確,成本低廉等特點(diǎn),可以滿足現(xiàn)場(chǎng)初篩,快速判定的要求。

酶聯(lián)免疫檢測(cè)法建立小分子免疫分析技術(shù),關(guān)鍵點(diǎn)有3個(gè):

人工抗原合成和抗體制備。酶和抗體標(biāo)記物的備。檢測(cè)技術(shù)方法學(xué)的建立。

LMG是小分子質(zhì),在免疫學(xué)上稱半抗原,必須要同大分子載體偶聯(lián)后才能免疫動(dòng)物制備抗體。無色孔雀石綠的修飾無色孔雀石綠的衍生化反應(yīng)途徑一、免疫原及包被抗原的制備

利用重氮化法將無色孔雀石綠修飾物與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)交聯(lián),制成免疫原及包被抗原二、多克隆抗體的制備將免疫原(LMG-BSA)與福氏完全佐劑以1∶1混溶,對(duì)兩只新西蘭大白兔進(jìn)行多次免疫(第一次動(dòng)物免疫將免疫原與福氏完全佐劑混溶,之后的動(dòng)物免疫將免疫原與福氏不完全佐劑混溶),經(jīng)5次免疫后,制得多克隆抗體。三、間接酶聯(lián)免疫吸附分析法步驟用包被抗原(LMG-OVA)包被酶標(biāo)板,200μL/孔，4℃過夜。用PBST緩沖液洗板3次,300μL/孔，加入1%Casein進(jìn)行封阻，室溫放置1h,洗板。加入抗體,標(biāo)液(或樣品稀釋液)各100μL/孔,室溫孵育1h。包被在酶標(biāo)板上的固定抗原(LMG-OVA)和添加的標(biāo)液中的LMG游離抗原與競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)。PBS洗滌扣干3次，游離的抗原抗體復(fù)合物被洗滌去除。加入用PBS稀釋的山羊抗兔IgG2辣根過氧化物酶偶合物(GaRIgG-HRP),200μL/孔,室溫1h。形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物固定在酶標(biāo)二抗上，洗板,。PBS洗滌扣干3次，游離的酶標(biāo)二抗被洗滌除去。加入TMB底物溶液200μL/孔,顯色,避光反應(yīng),在微量振蕩器上振搖約15～20min。加入5%硫酸,80μL/孔,終止反應(yīng)。結(jié)果處理：

用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定各孔溶液的吸光度(A)。標(biāo)準(zhǔn)溶液中無色孔雀石綠的濃度越大,吸光度越小。以A～logC作圖得到測(cè)定無色孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)曲線,從圖中可以算出檢