微生物制片顯微觀察及檢測技術(shù)

關(guān)于微生物制片顯微觀察及檢測技術(shù)第1頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四顯微操作顯微鏡是微生物檢驗中最常用的精密光學(xué)儀器。顯微鏡的種類很多，在實驗室中常用的有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。食品微生物檢驗中最常用的是普通光學(xué)顯微鏡。第2頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四顯微鏡的使用方法

用光學(xué)顯微鏡觀察微生物形態(tài)時，一般遵循先低倍鏡觀察，后高倍鏡觀察，再油鏡觀察。

第4頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四低倍鏡操作方法1.兩眼從側(cè)面注視低倍物鏡對準通光孔，使用粗調(diào)焦螺旋將鏡筒自上而下的調(diào)節(jié)，避免物鏡鏡頭接觸到玻片而損壞鏡頭和壓破玻片。當物鏡鏡頭與載物臺的玻片相距2～3mm時停止；2.左眼注視（注意右眼應(yīng)該同時睜著），并轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋，使鏡筒徐徐上升，直到看清物象為止；3.再用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。

注意：粗調(diào)調(diào)焦螺旋只用于上調(diào)載物臺，如觀察顯微鏡時，用粗調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，有壓碎載玻片、損壞物鏡的危險。因此，用細調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)視野使其更清晰第5頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四高倍鏡操作方法1.將低倍鏡觀察到的目標移動至視野中央；2.將低倍鏡鏡頭轉(zhuǎn)換成高倍鏡鏡頭。換用高倍鏡后，視野內(nèi)亮度變暗，因此一般選用較大的光圈并使用反光鏡的凹面；3.用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。觀看的物體數(shù)目變少，但是體積變大。

注意：高倍鏡觀察時，光線需增強。第6頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四油鏡操作方法1.將高倍鏡觀察到的目標移動至視野中央；2.將高倍鏡鏡頭挪開，于載玻片上滴一滴香柏油；3.將油鏡鏡頭移動至視野，讓油鏡鏡頭浸入香柏油（至油暈不再擴大為止）；4.用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。

注意：油鏡的操作需要較強的關(guān)線，故需將光線調(diào)至最強。

用10倍和/或40倍物鏡為隨后的高倍油鏡（90倍或100倍）選擇合適的視野（油鏡鏡筒上通常刻有H.I.OIL或OEL等標志）第7頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四油鏡用后的處理：第一遍：用擦鏡紙拭去鏡頭上的油；第二遍：用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去頭上殘留的油跡；第三遍：再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。第8頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四普通顯微鏡的保養(yǎng)

(1)觀察完后，移去觀察的載玻片標本。(2)用過油鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。(3)轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡的位置。

(4)將鏡身下降到最低位置，調(diào)節(jié)好鏡臺上標本移動器的位置，罩上防塵套。鏡頭清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙，物鏡的清洗，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。

第9頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四染色方法(一)簡單染色法

簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細菌染上顏色，觀察細菌的形態(tài)。第10頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四(二)復(fù)染色法

用兩種或多種染料染細菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。

革蘭氏染色法：不僅能觀察到細菌的形態(tài)，而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細菌，用G―表示細菌對革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。第11頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四實驗材料1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、蠟筆等。2.草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃紅染液、石炭酸復(fù)紅染液3.菌株：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌第12頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四實驗內(nèi)容與步驟(一)細菌的簡單染色步驟

涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢1．涂片取干凈的載玻片于實驗臺上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量培養(yǎng)物與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2．干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。

第13頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四3．固定手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。4．染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5．水洗斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。6．干燥用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時切勿將菌體擦掉。

7．鏡檢第14頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四(二)細菌的革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復(fù)染→水洗→干燥→觀察1．取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同。2．用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20~30s，隨即水洗。5．用蕃紅染液復(fù)染1min，水洗。6．用吸水紙吸掉水滴，待標本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。第15頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四革蘭氏染色圖解革蘭氏染色試劑

第16頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上

第17頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟2：用無菌操作法取少許培養(yǎng)物于蒸餾水滴上

第19頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟3：用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層

第20頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟4：風(fēng)干

第21頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟5：在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次固定第22頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟6：結(jié)晶紫染色1分鐘

第23頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片

第24頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟8：革蘭氏碘液染色1分鐘，再用蒸餾水輕輕沖洗

第25頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟9：酒精脫色至下滴液為無色，立即用蒸餾水沖洗

第26頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四步驟10：番紅復(fù)染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗

第27頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四大腸桿菌（Escherichiacoli）革蘭氏染色圖

革蘭氏染色陰性桿菌（紅色）

第28頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）革蘭氏染色

革蘭氏染色陽性球菌（紫色）

第29頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四注意事項1．革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認為革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴格把握脫色時間。2．選用培養(yǎng)18-24小時菌齡的細菌為宜，若細菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。3.干凈的玻片、熱固定、每一步水洗要徹底并且吸干等也是實驗成功的關(guān)鍵。第30頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第31頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四微生物檢測技術(shù)介紹檢測技術(shù)的重要性第32頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四革蘭氏染色鏡鑒按照標準進行傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定API試劑條菌鑒定國際金標準

半自動細菌鑒定儀（ATBExpression）

全自動細菌鑒定儀（VITEK2）微生物鑒定MiniVIDAS篩選系統(tǒng)免疫凝集/免疫沉淀實驗微生物檢測實時熒光定量PCR色譜、光譜分析技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)一、微生物檢驗技術(shù)介紹傳統(tǒng)篩選系統(tǒng)第33頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四微生物的檢測技術(shù)c)酶聯(lián)免疫熒光技術(shù)d)實時熒光定量PCRe)免疫磁珠技術(shù)b)乳膠凝集反應(yīng)a)常規(guī)培養(yǎng)鑒定法—顯色培養(yǎng)基法第34頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

顯色培養(yǎng)基

顯色培養(yǎng)基檢測基本原理：利用不同種屬細菌代謝所產(chǎn)生的酶的特異性，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特異性酶底物和抑制劑，當具有某特異酶的細菌與酶底物作用時，使顯色基團游離出來附著于菌落上，形成顏色獨特的菌落。根據(jù)菌落的顏色直接對菌屬（種）作出鑒定。第35頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

GB4789-2008、2010

中新技術(shù)的應(yīng)用-顯色培養(yǎng)基

沙門氏菌志賀菌副溶血性弧菌O157：H7大腸埃希菌單增李斯特菌阪崎腸桿菌大腸桿菌計數(shù)第36頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四顯色培養(yǎng)基的優(yōu)勢快速、簡便、節(jié)省時間-大多數(shù)顯色培養(yǎng)基只需在樣品增菌后，分離培養(yǎng)18~24h，即可根據(jù)菌落的顏色作出初步的鑒定。（陰性-棄去；陽性-進一步鑒定）。結(jié)果直觀，一目了然（根據(jù)顏色判定結(jié)果）。靈敏度高、特異性強，大大減少了后續(xù)的鑒定步驟（確證試驗）。第37頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四顯色培養(yǎng)的缺陷假陽性：97%的大腸埃希菌含有β-葡萄糖苷酶，約10%的沙門氏菌屬中也含有此酶。假陰性：O157：H7大腸埃希菌沒有β-葡萄糖苷酶，在MUG-LST上呈陰性反應(yīng)。不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培養(yǎng)基中呈陽性反應(yīng)。提示：這是任何選擇性培養(yǎng)基都無法避免的問題。與普通選擇性培養(yǎng)基比較，顯色培養(yǎng)基的假陽性、假陰性的機率相對要低得多。第38頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

乳膠凝集反應(yīng)

原理：乳膠凝劑試驗是以乳膠微粒為載體的間接凝集試驗。用人工方法將抗體包被于與免疫無關(guān)的大分子聚苯乙烯或羧化聚苯乙烯乳膠顆粒上。利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，當敏感的乳膠顆粒與待檢細菌菌懸液混合后，迅速形成肉眼可見的凝集團塊，用于篩選可疑菌。第39頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

常用Microgen乳膠凝集試驗盒

李斯特菌（listeria）沙門氏菌（salmonella）彎曲桿菌（camylobacter）大腸桿菌O157（E.coliO157）軍團菌（legionella）葡萄球菌（staph）第40頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

觀察凝集結(jié)果第41頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四全自動熒光免疫分析儀(VIDAS-mini或30)

檢測項目：食品及環(huán)境中常見致病性細菌（李斯特菌屬、單核增生李斯特菌、彎曲菌屬、大腸埃希菌O157、沙門氏菌屬、葡萄球菌腸毒素檢測）的快速篩檢第42頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四全自動熒光免疫分析儀(VIDAS)

原理：

以免疫技術(shù)捕獲目標微生物，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法，最后測藍色熒光（ELFA）。包被針上有抗體包被，所測得的熒光與標本中抗原的含量成正比。特點：結(jié)果準確：對每個標本做兩次免疫反應(yīng)，保證結(jié)果的可靠。靈敏度比可見光方法高出1000倍。已獲得美國FDA、日本厚生省、AOAC、USDA、中國進出口商品檢驗局等政府及權(quán)威機構(gòu)認可?？赏瑫r進行12個相同或不同的測試。每天進行約60—80項測試特異性強：標本不需分離出目標微生物即可上機檢測。避免交叉污染：沒有采樣針，避免標本之間交叉污染；樣品不與儀器接觸，儀器內(nèi)沒有抽吸樣品的管路，杜絕了標本對環(huán)境的污染第43頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四熒光定量PCR聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（PCR）是分子生物學(xué)技術(shù)最具有代表性的技術(shù)。它是一種能在體外將微量生物DNA分子進行數(shù)百萬倍放大的新型檢測技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，通過熒光染料的結(jié)合，將檢測信號進一步放大，其靈敏度是普通PCR的幾百倍，擴增和檢測過程由儀器自動完成，檢測同量高，速度快除去樣品前增菌時間，2-4小時內(nèi)可得到檢測結(jié)果微生物檢測限可能達到1copy，抗雜菌干擾能力強第44頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四

免疫磁珠技術(shù)由于受到抽樣數(shù)量、檢驗方法和試驗取樣量的限制，無法將全部樣品進行檢查。磁珠分離技術(shù)，能簡單快速地捕捉特異的蛋白、遺傳物質(zhì)和其他生物分子。通過免疫磁珠富集手段，將微量的目標物質(zhì)通過磁珠富集到可檢測的水平。這一技術(shù)不僅可應(yīng)用于致病微生物的檢測，還可用于食品中致敏原蛋白質(zhì)、核酸以及各類細菌毒素的富集，應(yīng)用范圍廣闊，適宜高通量、全自動操作。第45頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第46頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四Principle:ImmunomagneticMicroparticleSeparation/ConcentrationofBacterialCellsN第47頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四BioLumixTM微生物實時快速檢測系統(tǒng)是最新推出的用于食品、保健品、乳制品、肉制品、飲料、化妝品、洗化產(chǎn)品和制藥等工業(yè)領(lǐng)域和監(jiān)管部門等使用的微生物快速檢測系統(tǒng)?？梢钥焖俅_定樣本中細菌總數(shù)、大腸菌群/大腸桿菌、致病菌、霉菌等的存在與數(shù)量。第48頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四第49頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四BioLumixTM實時快檢系統(tǒng)----簡便、快速并可降低微生物試驗的操作成本。-裝有增菌培養(yǎng)基和指示劑的檢測管。-數(shù)小時內(nèi)得到檢測結(jié)果（而非數(shù)天）-結(jié)果易解釋并自動傳輸?shù)叫枰焖侔l(fā)運安全產(chǎn)品的地方。-非微生物專業(yè)技術(shù)人員也能夠操作。第50頁，共54頁，2023年，2月20日，星期四可檢測的項目:大腸菌群大腸桿菌腸桿菌科革蘭氏陰性菌乳酸菌酵母菌和霉菌假單胞菌蠟樣芽胞桿菌葡萄球菌沙門氏菌衛(wèi)生監(jiān)控保質(zhì)期預(yù)測腐敗菌檢測