人教教學(xué)基因工程基本操作程序

人教教學(xué)基因工程基本操作程序第1頁/共45頁1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個(gè)步驟第2頁/共45頁一、目的基因的獲取(一)目的基因主要是______________________,也可是一些具有調(diào)控作用的因子。目的基因的獲取方法主要有____________和___________兩大類編碼蛋白質(zhì)的基因（二）獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成法（反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法）如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等。直接分離法人工合成法第3頁/共45頁1、從基因文庫中獲取目的基因（1）基因文庫

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫第4頁/共45頁1、原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)：基因非編碼區(qū)：非編碼區(qū)：調(diào)控序列編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)終止子：終止轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子：啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶結(jié)合識別位點(diǎn)mRNA翻譯特定功能的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)：編碼區(qū)是連續(xù)的，非編碼區(qū)起調(diào)控作用DNA分子第5頁/共45頁2：真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)：基因非編碼區(qū)：非編碼區(qū)：編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)終止子啟動(dòng)子前體mRNA外顯子和內(nèi)含子都轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)：編碼區(qū)間隔不連續(xù)！分為內(nèi)含子和外顯子。編碼蛋白質(zhì)不編碼蛋白質(zhì)剪切掉內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分mRNADNA分子第6頁/共45頁提取某種生物的全部DNA適當(dāng)?shù)南拗泼敢欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組DNA分子基因組文庫導(dǎo)入受體菌（2）基因文庫的構(gòu)建方法①基因組文庫的構(gòu)建有啟動(dòng)子和內(nèi)含子第7頁/共45頁提取某生物特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌②cDNA文庫的構(gòu)建-----逆轉(zhuǎn)錄法：

部分基因：基因的選擇性表達(dá)無啟動(dòng)子和內(nèi)含子第8頁/共45頁

真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？有哪些差異？原核生物基因呢？思考？真核生物：無非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核生物：無非編碼區(qū)第9頁/共45頁（3）構(gòu)建基因文庫的目的

怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?便于在不知道目的基因核苷酸序列的情況下，獲得所需的目的基因。第10頁/共45頁依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性（4）從基因文庫中得到目的基因的方法第11頁/共45頁2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。②原理：__________多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制③前提__________一段已知目的基因的核苷酸序列第12頁/共45頁④過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一第13頁/共45頁：以_____方式擴(kuò)增，

指數(shù)⑤方式：⑥條件：模板DNA（含目的基因）四種脫氧核苷酸1對引物熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)一段已知目的基因的核苷酸序列第14頁/共45頁過程：第15頁/共45頁第16頁/共45頁P(yáng)CR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴(kuò)增第17頁/共45頁蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測推測3、人工合成法基因較小，核苷酸序列已知（化學(xué)合成法）

化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子嗎？需要模板嗎？第18頁/共45頁反轉(zhuǎn)錄法mRNARNA－DNA雜合雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶第19頁/共45頁（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過程:第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建第20頁/共45頁3、基因表達(dá)載體的組成？①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用2、基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的？（P162）目的基因必須在啟動(dòng)子與終止子之間目的基因啟動(dòng)子：基因的首端，RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子：基因的尾端，終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因第21頁/共45頁思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？第22頁/共45頁不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。第23頁/共45頁①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意第24頁/共45頁第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化——方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)——Ca2+處理法第25頁/共45頁1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn):能感染雙子葉植物和祼子植物,對大多數(shù)單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞整合植物細(xì)胞染色體DNA上表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第26頁/共45頁（2）基因槍法——微彈轟擊法特點(diǎn)：成本高適用于單子葉植物第27頁/共45頁（3）花粉通道法

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得第28頁/共45頁2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法:顯微注射技術(shù)操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射早期胚胎新性狀動(dòng)物早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)輸卵管或子宮胚胎移植技術(shù)受體細(xì)胞？原因？受體細(xì)胞：受精卵受精卵的全能性高一定是體內(nèi)受精嗎？不，可以體內(nèi)受精也可體外受精第29頁/共45頁第30頁/共45頁3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用法：常用菌：微生物作受體細(xì)胞原因：過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNACa2+處理法大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少Ca2+

改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)第31頁/共45頁植物基因工程動(dòng)物基因工程微生物基因工程常用方法受體細(xì)胞比較目的基因?qū)氩煌?xì)胞的方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2+處理法體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞第32頁/共45頁1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是A．結(jié)構(gòu)簡單、操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質(zhì)含量少、簡單D．性狀穩(wěn)定、變異少2、基因工程常用的受體細(xì)胞有①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動(dòng)植物細(xì)胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD3、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的步驟是A.人工合成基因B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D.目的基因的檢測和表達(dá)C第33頁/共45頁第四步目的基因的表達(dá)和檢測抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等抗原－抗體雜交法分子雜交法DNA分子雜交法受體是否具有轉(zhuǎn)基因特征個(gè)體水平目的基因是否翻譯目的基因是否轉(zhuǎn)錄目的基因是否導(dǎo)入分子水平方法檢測對象第34頁/共45頁（一）分子水平檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因，這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。DNA分子雜交技術(shù)

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第35頁/共45頁探針：用放射性同位素標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段第36頁/共45頁（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步。3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交技術(shù)方法:抗原抗體雜交②過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA如抗蟲棉：讓棉鈴蟲啃食棉鈴，看其是否死亡目的基因表達(dá)成功的標(biāo)志：通過轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)?；蚬こ坛晒Φ臉?biāo)志:生物個(gè)體表現(xiàn)出特定的性狀第37頁/共45頁練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）第38頁/共45頁練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

作探針進(jìn)行分子雜交檢測，又要用

方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。第39頁/共45頁有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A第40頁/共45頁C基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的步驟是A、人工合成目的基因B、目的基因的檢測和表達(dá)C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合（多選）人們利用基因工程的方法，用大腸桿菌生產(chǎn)人類胰島素，這一過程涉及到A.用適當(dāng)?shù)?/p>