三章節(jié)細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)(Electronmicroscopy)

掃描遂道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope）一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FM）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LCM）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）微分干涉顯微鏡（DIM）暗視野和倒置顯微鏡分辨率：指區(qū)分開(kāi)兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。光學(xué)顯微鏡的最小分辨率為0.2um，電子顯微鏡的最小分辨率為0.2nm。（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

組成：光學(xué)放大系統(tǒng)：目鏡和物鏡照明系統(tǒng)：光源、折光鏡、聚光鏡和濾光片機(jī)械和支架系統(tǒng)性能參數(shù)：分辨率（區(qū)分開(kāi)兩支點(diǎn)間的最小距離）（二）熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）原理與應(yīng)用

熒光素直接標(biāo)記技術(shù)

免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位研究：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

（三）激光共焦點(diǎn)掃描電鏡技術(shù)

（laserscanningconfocalmicroscopy）共焦點(diǎn)：是指物鏡和聚光鏡聚焦在同一個(gè)點(diǎn)上。應(yīng)用：排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。（四）相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)原理：光線通過(guò)不同密度的物質(zhì)，滯留程度不同，密度大，滯留的時(shí)間長(zhǎng)，否則時(shí)間短，從而產(chǎn)生光程差(相位差)，顯微鏡可以把這種光程差轉(zhuǎn)換為振幅差。反差的產(chǎn)生：以樣品種不同部位的密度差別為基礎(chǔ)，產(chǎn)生通過(guò)光程差，通過(guò)物鏡后面的差相板來(lái)夸大相位差，從而造成人眼可見(jiàn)的明暗區(qū)別。1.相差顯微鏡（phase－contrastmicroscope）特點(diǎn)和應(yīng)用：不需要染色，可觀察活細(xì)胞、細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)。在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)方面應(yīng)用廣泛，如血液的觀察，膿汁、分泌物的觀察，細(xì)胞癌變得早期診斷，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂現(xiàn)象的觀察等。2.微分干涉顯微鏡(differential－interferencemicroscope）

采用的是平面偏振光，通過(guò)棱鏡折射分成兩束，分不同的時(shí)間經(jīng)過(guò)樣品的相鄰部位，再通過(guò)棱鏡的匯合，夸大厚度的差別，從而造成明暗區(qū)別。應(yīng)用：觀察活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-fieldb)phase-contrastc)DIM倒置顯微鏡：由于物鏡、聚光鏡和光源的位置顛倒過(guò)來(lái)而得名。它的物鏡和聚光鏡之間的工作距離很長(zhǎng)，能直接對(duì)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行觀察。還可與電視錄像、相差物鏡、電影攝影等裝置相連。二、電子顯微鏡技術(shù)（EM）

透射式電子顯微鏡（TEM）

掃描式電子顯微鏡（SEM）

隧道式掃描電子顯微鏡（STM）

透射掃描電子顯微鏡（TSEM）

超高壓透射掃描電子顯微鏡電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡光路圖的比較顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可見(jiàn)光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的比較基本構(gòu)造：（1）電子束照明系統(tǒng)：電子槍和聚光鏡（2）成像系統(tǒng)：物鏡、中間鏡和投影鏡（3）真空系統(tǒng)（4）記錄系統(tǒng)：熒光屏和感光膠片電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)負(fù)染色技術(shù)冷凍斷裂和冷凍蝕刻技術(shù)三維重構(gòu)技術(shù)噴鍍技術(shù)1.超薄切片技術(shù)電子顯微鏡技術(shù)對(duì)樣品的要求：（1）樣品薄，一般是數(shù)十納米（2）保持樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)超薄切片技術(shù)樣品的厚度為40－50nm固定脫水包埋修塊（粗修和細(xì)修）切片染色（醋酸鈾、硝酸鈾和鉛）超薄切片技術(shù)的步驟路線（1）戊二醛1963年開(kāi)始用作超薄切片的固定劑。作用原理：醛基和蛋白質(zhì)、磷脂中的氨基結(jié)合，把相鄰的蛋白質(zhì)交聯(lián)起來(lái)，形成不可溶的網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于蛋白質(zhì)、多糖和核酸的固定效果好，對(duì)脂類的差。優(yōu)點(diǎn)：分子量小，比較容易進(jìn)入細(xì)胞，固定的標(biāo)本可大些（小于1－2mm）。（2）甲醛是一種易揮發(fā)的還原劑，常用于光學(xué)顯微鏡的固定劑，在電子顯微鏡中，用磷酸緩沖液配制的甲醛溶液最為前固定劑。缺點(diǎn)：含有甲醇，容易使細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。（4）高錳酸鉀是一種強(qiáng)氧化劑，多用于細(xì)菌和組織培養(yǎng)技術(shù)。（3）餓酸

是一種強(qiáng)氧化劑，可與氮結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)、脂類的固定效果好，可與細(xì)胞的所有成分發(fā)生化學(xué)結(jié)合，產(chǎn)生電子反差，起“電子染色”的作用，不會(huì)使組織變硬、變脆，便于超薄切片。缺點(diǎn)：對(duì)糖類和核酸的保存差；分子較大，滲透力弱，使固定不均勻；固定時(shí)間不能久，否則脂蛋白復(fù)合體溶解，組織塊發(fā)脆，造成切片困難；有毒，對(duì)呼吸道粘膜和眼角膜有固定作用；價(jià)格昂貴。超薄切片技術(shù)的應(yīng)用：除了單獨(dú)應(yīng)用于組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)觀察外，還可與放射性同位素自顯影、細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡和電鏡原位雜交等技術(shù)結(jié)合，用于不同目的的研究。放射性同位素自顯影：同位素引入（注射、飼喂、培養(yǎng)）制片（常規(guī)石蠟切片）涂乳膠（液體感光劑）曝光顯影、定影染色、觀察又稱陰性反差染色，由Hall（1955）和Huxley（1957）首先采用。負(fù)染法是將顆?；蛘呃w維樣品分散在具有親水性支持膜的載網(wǎng)上，然后滴加磷鎢酸或醋酸雙氧鈾等染料，并隨即吸去多于地染液，樣品干燥后殘余染料將沉積在樣品的周圍以及樣品的凹陷、縫隙處，而樣品本身呈淺色，所以稱為負(fù)染。2.負(fù)染色（negativestaining）技術(shù)負(fù)染色技術(shù)步驟：樣品分離與提純制備懸浮液滴樣染色觀察Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).又稱為冷凍蝕刻、冷凍斷裂，是一種由冷凍斷裂和復(fù)型相結(jié)合的樣品制備技術(shù)。由Hall于1950年提出，1957年開(kāi)始應(yīng)用于生物樣品的制備。操作步驟：迅速冷凍使樣品固定、硬化，在真空中切斷，使冰升華，暴露出斷裂面的結(jié)構(gòu)，再在切面上噴鍍一層鉑，碳投影，形成復(fù)型膜，在電鏡下觀察。優(yōu)點(diǎn)：(1)能較好的保存生物大分子的天然特征(2)可用于顯示各類膜結(jié)構(gòu)(3)分辨力強(qiáng)，反差好(4)顯示圖象具有立體浮雕感(5)樣品可長(zhǎng)期保存。缺點(diǎn)：技術(shù)難度大，易產(chǎn)生冰晶損傷。

3.冰凍蝕刻（freezeetching）技術(shù)噴鍍技術(shù)：是電子顯微鏡中一種重要的增強(qiáng)背景和待觀察樣品反差的方法。5.掃描電子顯微鏡技術(shù)（SEM）SEM：掃描電子顯微鏡STEM：掃描透射電子顯微鏡STM：掃描隧道顯微鏡AFM：原子力顯微鏡是在STM基礎(chǔ)上的一種顯微鏡。X射線衍射技術(shù)：STM的主要裝置包括實(shí)現(xiàn)X、Y、Z三個(gè)方向掃描的壓電陶瓷、逼近裝置、電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理顯示系統(tǒng)。STM的主要特點(diǎn)；1.具有原子尺度的高分辨率。側(cè)分辨率0.1-0.2nm，縱分辨率0.001nm；2.可以在真空、大氣、液體等多種條件下工作。3.非破壞性測(cè)量。與其功能相似的還有原子力顯微鏡等十于種。第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物1.離心分離技術(shù)（1）速度離心分離（差速離心、移動(dòng)區(qū)帶離心也稱密度梯度離心）（2）等密度離心技術(shù)2.層析分離技術(shù)：層析是廣泛應(yīng)用分離蛋白質(zhì)的方法，根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計(jì)的物理分離方法?；咎攸c(diǎn)：有一個(gè)固定相和流動(dòng)相。（1）凝膠過(guò)濾層析：又稱排阻層析或分子篩法，根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。葡萄糖或瓊脂糖。（2）離子交換層析：根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷進(jìn)行分離和純化。（3）親和層析：生物分子中的特定部位能夠同其他分子相互識(shí)別結(jié)合，如酶與底物、抗體與抗原的識(shí)別結(jié)合，結(jié)合是特異的、可逆的。二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)等的顯示方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（1）原代細(xì)胞：1-10代從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)