三章節(jié)細胞生物學研究方法

第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法光學顯微鏡技術（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(Electronmicroscopy)

掃描遂道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope）一、光學顯微鏡技術普通復式光學顯微鏡技術

熒光顯微鏡技術（FM）

激光共焦掃描顯微鏡技術（LCM）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）微分干涉顯微鏡（DIM）暗視野和倒置顯微鏡分辨率：指區(qū)分開兩個質點間的最小距離。光學顯微鏡的最小分辨率為0.2um，電子顯微鏡的最小分辨率為0.2nm。（一）普通復式光學顯微鏡技術

組成：光學放大系統(tǒng)：目鏡和物鏡照明系統(tǒng)：光源、折光鏡、聚光鏡和濾光片機械和支架系統(tǒng)性能參數(shù)：分辨率（區(qū)分開兩支點間的最小距離）（二）熒光顯微鏡技術

（FluorescenceMicroscopy）原理與應用

熒光素直接標記技術

免疫熒光標記技術

在光鏡水平用于特異蛋白質等生物大分子的定性定位研究：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應用

（三）激光共焦點掃描電鏡技術

（laserscanningconfocalmicroscopy）共焦點：是指物鏡和聚光鏡聚焦在同一個點上。應用：排除焦平面以外光的干擾，增強圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構樣品的三維結構。（四）相差和微分干涉顯微鏡技術原理：光線通過不同密度的物質，滯留程度不同，密度大，滯留的時間長，否則時間短，從而產生光程差(相位差)，顯微鏡可以把這種光程差轉換為振幅差。反差的產生：以樣品種不同部位的密度差別為基礎，產生通過光程差，通過物鏡后面的差相板來夸大相位差，從而造成人眼可見的明暗區(qū)別。1.相差顯微鏡（phase－contrastmicroscope）特點和應用：不需要染色，可觀察活細胞、細胞核、線粒體等細胞器的動態(tài)。在醫(yī)學和生物學方面應用廣泛，如血液的觀察，膿汁、分泌物的觀察，細胞癌變得早期診斷，細胞的運動、細胞分裂現(xiàn)象的觀察等。2.微分干涉顯微鏡(differential－interferencemicroscope）

采用的是平面偏振光，通過棱鏡折射分成兩束，分不同的時間經過樣品的相鄰部位，再通過棱鏡的匯合，夸大厚度的差別，從而造成明暗區(qū)別。應用：觀察活細胞中較大的細胞器。AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-fieldb)phase-contrastc)DIM倒置顯微鏡：由于物鏡、聚光鏡和光源的位置顛倒過來而得名。它的物鏡和聚光鏡之間的工作距離很長，能直接對培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)細胞進行觀察。還可與電視錄像、相差物鏡、電影攝影等裝置相連。二、電子顯微鏡技術（EM）

透射式電子顯微鏡（TEM）

掃描式電子顯微鏡（SEM）

隧道式掃描電子顯微鏡（STM）

透射掃描電子顯微鏡（TSEM）

超高壓透射掃描電子顯微鏡電子顯微鏡與光學顯微鏡光路圖的比較顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差電子顯微鏡與光學顯微鏡的比較基本構造：（1）電子束照明系統(tǒng)：電子槍和聚光鏡（2）成像系統(tǒng)：物鏡、中間鏡和投影鏡（3）真空系統(tǒng)（4）記錄系統(tǒng)：熒光屏和感光膠片電鏡制樣技術超薄切片技術負染色技術冷凍斷裂和冷凍蝕刻技術三維重構技術噴鍍技術1.超薄切片技術電子顯微鏡技術對樣品的要求：（1）樣品薄，一般是數(shù)十納米（2）保持樣品的精細結構超薄切片技術樣品的厚度為40－50nm固定脫水包埋修塊（粗修和細修）切片染色（醋酸鈾、硝酸鈾和鉛）超薄切片技術的步驟路線（1）戊二醛1963年開始用作超薄切片的固定劑。作用原理：醛基和蛋白質、磷脂中的氨基結合，把相鄰的蛋白質交聯(lián)起來，形成不可溶的網絡。對于蛋白質、多糖和核酸的固定效果好，對脂類的差。優(yōu)點：分子量小，比較容易進入細胞，固定的標本可大些（小于1－2mm）。（2）甲醛是一種易揮發(fā)的還原劑，常用于光學顯微鏡的固定劑，在電子顯微鏡中，用磷酸緩沖液配制的甲醛溶液最為前固定劑。缺點：含有甲醇，容易使細胞的超微結構發(fā)生變化。（4）高錳酸鉀是一種強氧化劑，多用于細菌和組織培養(yǎng)技術。（3）餓酸

是一種強氧化劑，可與氮結合。優(yōu)點：蛋白質、脂類的固定效果好，可與細胞的所有成分發(fā)生化學結合，產生電子反差，起“電子染色”的作用，不會使組織變硬、變脆，便于超薄切片。缺點：對糖類和核酸的保存差；分子較大，滲透力弱，使固定不均勻；固定時間不能久，否則脂蛋白復合體溶解，組織塊發(fā)脆，造成切片困難；有毒，對呼吸道粘膜和眼角膜有固定作用；價格昂貴。超薄切片技術的應用：除了單獨應用于組織細胞的結構觀察外，還可與放射性同位素自顯影、細胞化學、免疫電鏡和電鏡原位雜交等技術結合，用于不同目的的研究。放射性同位素自顯影：同位素引入（注射、飼喂、培養(yǎng)）制片（常規(guī)石蠟切片）涂乳膠（液體感光劑）曝光顯影、定影染色、觀察又稱陰性反差染色，由Hall（1955）和Huxley（1957）首先采用。負染法是將顆?；蛘呃w維樣品分散在具有親水性支持膜的載網上，然后滴加磷鎢酸或醋酸雙氧鈾等染料，并隨即吸去多于地染液，樣品干燥后殘余染料將沉積在樣品的周圍以及樣品的凹陷、縫隙處，而樣品本身呈淺色，所以稱為負染。2.負染色（negativestaining）技術負染色技術步驟：樣品分離與提純制備懸浮液滴樣染色觀察Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).又稱為冷凍蝕刻、冷凍斷裂，是一種由冷凍斷裂和復型相結合的樣品制備技術。由Hall于1950年提出，1957年開始應用于生物樣品的制備。操作步驟：迅速冷凍使樣品固定、硬化，在真空中切斷，使冰升華，暴露出斷裂面的結構，再在切面上噴鍍一層鉑，碳投影，形成復型膜，在電鏡下觀察。優(yōu)點：(1)能較好的保存生物大分子的天然特征(2)可用于顯示各類膜結構(3)分辨力強，反差好(4)顯示圖象具有立體浮雕感(5)樣品可長期保存。缺點：技術難度大，易產生冰晶損傷。

3.冰凍蝕刻（freezeetching）技術噴鍍技術：是電子顯微鏡中一種重要的增強背景和待觀察樣品反差的方法。5.掃描電子顯微鏡技術（SEM）SEM：掃描電子顯微鏡STEM：掃描透射電子顯微鏡STM：掃描隧道顯微鏡AFM：原子力顯微鏡是在STM基礎上的一種顯微鏡。X射線衍射技術：STM的主要裝置包括實現(xiàn)X、Y、Z三個方向掃描的壓電陶瓷、逼近裝置、電子學反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理顯示系統(tǒng)。STM的主要特點；1.具有原子尺度的高分辨率。側分辨率0.1-0.2nm，縱分辨率0.001nm；2.可以在真空、大氣、液體等多種條件下工作。3.非破壞性測量。與其功能相似的還有原子力顯微鏡等十于種。第二節(jié)細胞組分的分析方法一、用超速離心技術分離細胞器與生物大分子及其復合物1.離心分離技術（1）速度離心分離（差速離心、移動區(qū)帶離心也稱密度梯度離心）（2）等密度離心技術2.層析分離技術：層析是廣泛應用分離蛋白質的方法，根據(jù)蛋白質的形態(tài)、大小和電荷的不同而設計的物理分離方法?；咎攸c：有一個固定相和流動相。（1）凝膠過濾層析：又稱排阻層析或分子篩法，根據(jù)蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。葡萄糖或瓊脂糖。（2）離子交換層析：根據(jù)蛋白質所帶電荷進行分離和純化。（3）親和層析：生物分子中的特定部位能夠同其他分子相互識別結合，如酶與底物、抗體與抗原的識別結合，結合是特異的、可逆的。二、細胞內核酸、蛋白質、酶、糖類與脂質等的顯示方法第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術一、細胞培養(yǎng)1.動物細胞培養(yǎng)（1）原代細胞：1-10代從機體取出后立即培養(yǎng)的細