三基因工程常用受體細胞

第二節(jié)、宿主細胞分類及特點分類：原核細胞（大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等）真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞）第2頁/共57頁一、原核表達系統(tǒng)的特點（一）優(yōu)點：1、結構簡單，基因組成及功能相對清楚，易于遺傳操作及轉化2、生理代謝途徑及表達調控機制相對清楚，便于表達調控3、生長迅速，要求條件低（大腸桿菌倍增時間為17分鐘），易于大規(guī)模培養(yǎng)。第3頁/共57頁（二）缺點1、不能識別剪切內含子，不能表達基因組DNA，只能表達cDNA；2、缺乏真核生物的蛋白質加工修飾系統(tǒng)，不能進行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙?；?、硫酸化、酰胺化等修飾作用；

蛋白酶解作用：從蛋白前體中切去一段氨基酸序列，從而獲得功能性分子

糖基化意義：賦予蛋白獨特的結合性并增強穩(wěn)定性3、不具備真核生物的蛋白質復性系統(tǒng)（如蛋白二硫鍵異構酶），不能進行真核蛋白的正確折疊；第4頁/共57頁二、酵母（yeast）表達體系特點酵母菌是最簡單的真核單細胞生物；是外源真核基因最理想的表達體系。

第5頁/共57頁（一）優(yōu)點：

1、全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便

2、具有原核生物無法比擬的蛋白翻譯后加工修飾系統(tǒng)。對表達的蛋白可進行正確折疊和糖基化、磷酸化等修飾；

3、安全：不含特異病毒、不產生毒素，美國FDA認定為安全的

4、繁殖迅速（倍增期約2小時），要求條件低，大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單，成本低廉；

5、能外分泌第6頁/共57頁（二）缺點：1、生長相對細菌緩慢2、對有些生物活性蛋白仍無法表達或正確修飾，比如蛋白超糖基化第7頁/共57頁超糖基化修飾作用酵母菌糖蛋白的N－糖基外鏈的組成成分只有甘露糖，但其分支結構極為復雜的的現象稱為超糖基化修飾作用。

酵母菌高等真核生物O－寡聚多糖鏈甘露糖單體唾液酸基團N－糖基外側鏈甘露糖甘露糖

N－乙酰葡萄糖胺半乳糖果糖唾液酸等第8頁/共57頁N-連接糖基化(N-linkedglycosylation)

新合成蛋白進行糖基化修飾的一種方式。糖通過與蛋白質的天冬氨酸的自由NH2基連接，所以將這種糖基化稱為N-連接的糖基化。第9頁/共57頁O-連接的糖基化（O-linkedglycosylation）高爾基體中進行的另一種蛋白質的糖基化，將糖鏈轉移到多肽鏈的絲氨酸、蘇氨酸或羥賴氨酸的羥基的氧原子上。第10頁/共57頁三、哺乳動物細胞表達特點是表達哺乳動物基因（如人基因）的最好受體細胞。優(yōu)點：1、能識別和剪切內含子并加工為成熟的mRNA，既可表達cDNA又可表達基因組DNA；2、表達產物具有正確地高級結構和糖基化、磷酸化等修飾。3、表達產物可分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。第11頁/共57頁缺點：1、細胞生長慢，培養(yǎng)條件刻苛，大規(guī)模培養(yǎng)工藝復雜、費用高2、培養(yǎng)液中產物濃度較小3、轉化細胞篩選麻煩第12頁/共57頁

主要基因工程表達體系比較表達體系產物產生部位培養(yǎng)方式提純產物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質菌體內容易一般對原核好不大融合蛋白質部分高產對真核差酵母多肽蛋白質菌體內容易菌體內真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產稍復雜天然產物哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達天然需注意糖基化蛋白可高產產物致癌第13頁/共57頁第三節(jié)、常用原核表達細胞大腸桿菌枯草芽孢桿菌短小芽孢桿菌第14頁/共57頁一、大腸桿菌表達體系（一）生物學特性革蘭氏陰性桿菌大小2～4um×0.4～0.1um；無芽孢；一般無莢膜(capsule)裂殖(Fission)分裂，37℃17分鐘繁殖一代。第15頁/共57頁（二）特點優(yōu)點：1、載體受體系統(tǒng)完備2、外源基因表達水平高，可達總蛋白5％～30％；3、下游技術成熟第16頁/共57頁缺點：1、胞內表達蛋白易形成無活性的包涵體，需進行復性操作；可溶性表達的胞內真核蛋白易被細菌蛋白酶水解2、蛋白分泌機制不健全，外源真核基因很難實現分泌表達，且分泌產物大多只能分泌到細胞周質（細胞質與外膜之見的間隙）；少數分泌表達的蛋白表達效率比包含體形式低很多。3、胞內表達產物蛋白質N端多余一個甲硫氨酸殘基（由起始密碼ATG編碼），影響活性或容易引起免疫反應

4、細胞壁含脂多糖（內毒素），增加了分離純化難度第17頁/共57頁包涵體細胞內由生物大分子致密聚集形成的被膜包裹或無膜的水不溶顆粒狀物（相差顯微鏡或電子顯微鏡下可見）。組成：1、外源重組蛋白：50％以上2、宿主蛋白：RNA聚合酶、核糖核蛋白體、外膜蛋白等3、質粒編碼蛋白：如標記基因產物4、非蛋白分子：DNA、RNA、脂多糖等蛋白特點：氨基酸序列組成正確，空間構象往往錯誤第18頁/共57頁（三）在基因工程中的應用擴增外源DNA（雙鏈、單鏈）構建基因文庫（DNA文庫、cDNA文庫）高效表達原核生物基因表達不需翻譯后加工、修飾的真核蛋白第19頁/共57頁五、實驗室常用的大腸桿菌

用于接受質粒：C600W3110HB101JM83

JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654

第20頁/共57頁二、芽孢桿菌（Bacillussubtilis）表達體系（一）生物學特性革蘭氏陽性桿菌大小0.7～0.8×2～3m能產生芽孢；第21頁/共57頁（二）特點優(yōu)點：1、具有高效分泌機制，可將表達的外源蛋白高效分泌到培養(yǎng)基中，且多數真核蛋白經芽孢桿菌分泌后便具有天然構象和生物活性2、胞壁不含脂多糖，不產生內毒素第22頁/共57頁缺點1、載體受體系統(tǒng)不完備2、常規(guī)方法不易轉化3、野生型芽孢桿菌合成和分泌大量的胞外蛋白酶，直接影響表達產物的穩(wěn)定性4、發(fā)酵技術不如大腸桿菌成熟第23頁/共57頁（三）基因制藥目前普遍使用的芽孢菌表達系統(tǒng)及載體枯草芽孢桿菌：蛋白分泌能力強，但同時至少分泌6種蛋白酶短小芽孢桿菌：蛋白分泌能力與枯草芽孢桿菌接近，但胞外蛋白酶活性遠低于枯草芽孢桿菌，且可分泌蛋白酶抑制劑第24頁/共57頁多重蛋白酶基因缺陷枯草芽孢桿菌受體菌DB428﹥WB500﹥WB600DB428、WB500、WB600蛋白酶活性分別只及野生型的3.1％、0.8％、0.3％，若加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）則WB600胞外檢測不到蛋白酶活性。第25頁/共57頁兩株胞外蛋白分泌水平較高的短小芽孢桿菌野生株芽孢桿菌47株HPD31株在合適培養(yǎng)條件下，每升培養(yǎng)液可積累30g蛋白產物第26頁/共57頁芽孢桿菌使用的表達載體pNU210PYQLpUB18第27頁/共57頁（四）在基因工程制藥中的應用重組蛋白多肽藥物的分泌表達白細胞介素－2白細胞介素－3表皮生長因子（EGF）人－干擾素乙肝病毒核心抗原第28頁/共57頁第四節(jié)、基因制藥常用酵母表達細胞釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)）乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）多型漢遜酵母（Hansenulapolymorpha）

第29頁/共57頁一、釀酒酵母是第一個用于基因藥物表達的酵母菌，遺傳背景已相當清楚：有17條染色體，1996年完成其全基因組測序，基因組為12068kb，閱讀開放開架5887個，編碼約6000個基因，比單細胞的原核生物和古細菌大一個數量級。受體細胞舉例：釀酒酵母GRF18第30頁/共57頁應用1981年釀酒酵母表達了第一個外源基因一干擾素基因，隨后又有一系列外源基因在該系統(tǒng)得到表達。

FDA批準的第一個基因工程疫苗就是釀酒酵母表達的乙肝疫苗（Merck公司）上市產品還有人胰島素（丹麥Novo－Nordisk公司）和人粒細胞集落刺激因子（Immunex公司）等第31頁/共57頁存在問題1、外源基因表達水平不高。原因：（1）密碼子使用的偏向性（tRNA與外源基因密碼子不匹配）（2）乙醇發(fā)酵途徑活躍導致生物大分子合成普遍受到抑制（3）質粒的不穩(wěn)定性2、重組異源蛋白超糖基化修飾第32頁/共57頁二、巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）是近年來發(fā)展最為迅速，應用最為廣泛的酵母細胞。是一種甲基營養(yǎng)菌，能在相對較為廉價的甲醇培養(yǎng)基中生長。第33頁/共57頁優(yōu)點

除具有一般酵母所具有的特點外，還有以下幾個優(yōu)點：1、具有目前最強，調控機理最嚴格的啟動子之一－乙醇氧化酶AOX1基因啟動子,外源蛋白表達量高（一般500-4000mg/L，最高為破傷風毒素C達到12g/l）。2、表達質粒能在基因組的特定位點穩(wěn)定整合。3、蛋白產物糖基化修飾作用大多數情況下接近哺乳動物細胞且可直接以天然可溶形式分泌到胞外。第34頁/共57頁缺點發(fā)酵周期長，要添加甲醇分子生物學基礎不清楚，遺傳改造難度大。第35頁/共57頁應用

生產重組真核藥物蛋白：近年來，Invitrogon公司開發(fā)了畢赤酵母表達系統(tǒng)的系列產品，短短幾年已經有300多種外源蛋自在該系統(tǒng)得到有效表達，被認為是目前最有效的酵母表達系統(tǒng)。藥物蛋白已有20多種，見李元《基因工程藥物》P52表。如人IL－2、人血清白蛋白、TNF、HBsAg、EGF、破傷風毒素C片斷、人巨細胞病毒抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物等，有些即將進入市場。第36頁/共57頁常用畢氏酵母菌

KM71和GS115:都具有HIS4營養(yǎng)缺陷標記。

GS115茵株：具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；

KM71菌株：AOX1位點被ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型共同特點:為組氨醇脫氫酶缺陷株，與帶有his標記基因的表達質粒配合使用第37頁/共57頁三、乳酸克魯維酵母具有可穩(wěn)定存在的附加體型質粒pKD1載體及高拷貝整合型質粒pMIRK1外源基因表達水平比釀酒酵母高，如由重組乳酸克魯維酵母合成的人IL－1β是重組釀酒酵母的80－100倍。第38頁/共57頁四、多型漢遜酵母表達系統(tǒng)蛋白糖基化修飾作用接近哺乳動物細胞。也是一種甲基營養(yǎng)菌。第39頁/共57頁舉例：利用重組酵母生產乙肝疫苗第一代乙肝疫苗：病毒攜帶者體內提取存在問題：1、來源有限2、提取過程復雜3、致病潛在危險4、成本高第40頁/共57頁第二代乙肝疫苗－重組乙肝疫苗第一階段：大腸桿菌重組乙肝疫苗。20世紀70年代末嘗試用大腸桿菌表達乙肝表面抗原HBsAg，但表達水平極低第二階段：釀酒酵母重組乙肝疫苗。起始于20世紀80年代初，將HBsHg（或s多肽）的編碼序列置于ADH1（釀酒酵母的乙醇脫氫酶1基因）啟動子或PGK（磷酸甘油酯激酶基因）啟動子后面，表達出具有免疫活性的非糖基化HBsHg。目前已作為乙肝疫苗商品化，商品名為Recombivax－B或Engerix－B。第41頁/共57頁第三階段：巴斯德畢赤酵母重組乙肝疫苗HBsAg基因穩(wěn)定整合在巴斯德畢赤酵母染色體上表達產物量比在釀酒酵母中高1倍，并且表達蛋白效價高出釀酒酵母數十倍。第42頁/共57頁第五節(jié)、常用哺乳動物表達細胞能在培養(yǎng)基中無限生長的哺乳動物細胞系。一般為與正常細胞生理特性基本接近、無平面接觸抑制特性的腫瘤細胞系或異倍體連續(xù)細胞系第43頁/共57頁有限細胞系和無限細胞系有限細胞系（finitecellline）：正常細胞經過多次傳代后，一般可連續(xù)培養(yǎng)30～50代，就會逐漸失去增殖能力，也就是說它們只能生長有限的時間，經過若干傳代培養(yǎng)后將老化死亡，把這類細胞稱為有限細胞系。無限細胞系（infinitecellline）或連續(xù)細胞系（continuouscellline）：當細胞經過自然或人為的因素轉化為異倍體后，能變?yōu)闊o限細胞系，沒有分裂次數的限制。第44頁/共57頁藥物生產應用的主要細胞系非洲綠猴腎細胞（COS）、中國倉鼠卵巢細胞（CHO）、小倉鼠腎細胞（BHK）、人胚胎腎細胞（HEK－239）、C127用于基因瞬時表達：COS、BHK、HEK－239用于基因穩(wěn)定表達：CHO第45頁/共57頁一、CHO細胞（Chinesehamsterovarycells）（一）一般特性：分離自中國倉鼠卵巢（Chinesehamsterovary，CHO）上皮樣細胞，貼壁生長型對水泡性口炎和Getah病毒敏感。第46頁/共57頁細胞貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)

第47頁/共57頁（二）優(yōu)點

1、外源基因整合到宿主細胞后能穩(wěn)定保持；2、可分泌表達外源蛋白，而內源蛋白分泌很少。3、蛋白質翻譯后的修飾準確，表達產物的結構、性質和生物活性接近天然。4、培養(yǎng)條件要求低。對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力；能在無血清的條件生長。第48頁/共57頁（三）應用有多個衍生突變株應用于藥物的生產，培養(yǎng)時需要添加脯氨酸。采用二氫葉酸還原酶（DHFR）的缺陷株（*CHO/dhFr）表達的藥物有人組織性纖溶酶原激活劑

tPA、IFN－、IFN－、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ等已投放市場?？稍谠诎奔柞｀┻剩╩ethotrexate,MTX）存在下，增加外源基因的拷貝數，提高蛋白的表達水平，使外源基因高效表達。

第49頁/共57頁二、BHK細胞（一）一般特性：分離自幼倉鼠的腎臟（babyhamsterkidney,BHK）

成纖維樣細胞，非整倍體，2n=44。（二）應用：用于增殖病毒制備疫苗和重組蛋白。兩種重組凝血因子Ⅷ，Bayer的Kogenate

FS、AventisBehring的Helixate分別于1989和1994被FDA獲準上市，1999年FDA批準NovoNordisk的重組凝血因子VIIa（NovoSeven）上市，用于治療血友病。

第50頁/共57頁三、C127細胞（一）一般特性：

分離自小鼠乳腺腫瘤上皮樣細胞，貼壁型生長。被牛乳頭瘤病毒（bovinepolyomavirus，BPV）DNA載體轉染后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。（二）常用細胞系：

C127：LT細胞系：生長密度高，表達組成型大T抗原。

C127I細胞：適合于牛乳頭瘤病毒DNA載體的轉化。（三）應用：已表達多種外源基因，Serono公司生產rhGH