人類疾病模型與模式化實驗動物飼料淺談

模式化實驗動物飼料是確保實驗動物疾病造模成功的關鍵因素之一。實驗動物標準化的實驗動物飼料是維持該“試劑”標準化的重要基礎。實驗動物被譽為活試劑，是一切疾病模型、毒理研究的載體。當前1頁，總共40頁。缺VD3飼料缺賴氨酸飼料缺鈣飼料高鈣飼料高鐵飼料高蛋白質飼料缺鉻飼料模式化實驗動物飼料食源性肥胖模型飼料胰島素抵抗/糖尿病模型飼料非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型飼料動脈粥樣硬化模型飼料高血壓模型飼料當前2頁，總共40頁。肥胖食源性肥胖癥高脂飼料誘導的食源性肥胖癥（DIO）遺傳與環(huán)境因素是肥胖的主因，飲食因素是誘發(fā)肥胖的主要環(huán)境因素。嚙齒類動物在高脂誘導下很容易長胖，是非常有效的食源性肥胖癥（Diet-InducedObesity,DIO）的研究工具[1,2]。當前3頁，總共40頁。肥胖食源性肥胖癥（DIO）高脂飼料誘導的DIODIO誘導飼料:30~45kcal%脂肪（粗脂肪13~18%，粗蛋白18~20%）高脂日糧

DIO對照飼料:10~11kcal%脂肪（粗脂肪4~5%，粗蛋白18~20%）低脂日糧飼喂該高脂料6~8周能引起大鼠、小鼠營養(yǎng)性肥胖，且大鼠伴隨高血脂和高血糖，小鼠伴隨高膽固醇和高血糖，為人類營養(yǎng)性肥胖伴發(fā)高脂血癥、高膽固醇血癥和高血糖提供了研究方便【3-4】。當前4頁，總共40頁。食源性肥胖造模常用飼料配方配方成分1[7]酪蛋白200g，玉米淀粉72.8g，麥芽糊精100g，蔗糖172.8g，纖維素50g，大豆油25g，豬油177.5g，l-胱氨酸3g，礦物質預混料45g，復合維生素10g，酒石酸膽堿2g2[7]酪蛋白200g，麥芽糊精125g，蔗糖68.8g，纖維素50g，大豆油25g，豬油245g，l-胱氨酸3g，礦物質預混料45g，復合維生素10g，酒石酸膽堿2g3[8]酪蛋白35.5%，蔗糖20%，豬油40%，無機鹽混合物3.5%，維生素混合物1%4[8]基礎料65%，奶粉15%，花生油10%，豬油10%5[9]基礎料70%，奶粉10%，蛋黃粉10%，豬油10%，魚肝油10滴6[10]基礎料75.3%，蛋黃粉12%，奶油12%，膽固醇0.5%，膽鹽0.2%7[11]基礎料79%，蛋黃粉10%，豬油10%，膽固醇1%8[12]基礎料82.8%，蛋黃粉5%，豬油10%，膽固醇2%，甲基硫氧嘧啶0.2%當前5頁，總共40頁。動物模型

雖然大多數(shù)嚙齒類動物在攝食高脂飼料后都會發(fā)胖，但是在體重增加、葡萄糖耐受水平、胰島素抗性、甘油三酯水平及其他生理指標上存在品系差異性。小鼠高脂飼料近交易感品系小鼠：C57BL/6、AKR。

用58Kcal%脂肪的高脂飼料飼喂這兩種小鼠，體重增加相同，但C57BL/6比AKR對葡萄糖更加耐受[13]

。表現(xiàn)單一肥胖抵抗的小鼠品系：SWR/J、A/J[14,15]。封閉群的SD大鼠與Wistar大鼠是常用DIO品系，特別是SD大鼠。SD大鼠對32或45Kcal%脂肪的高脂飼料存在個體差異性，可用于肥胖（DIO）與肥胖抵抗（DR）的研究[16,17]。大鼠當前6頁，總共40頁。[18]如圖所示，隨著周齡的增加，DIO組與DR組的大鼠體重差異增大[18]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂或高脂高糖飼料造模結果只有部分可誘導成肥胖，約有一半的動物存在食物抵抗，不能誘導成營養(yǎng)性肥胖[19]。當前7頁，總共40頁。幼年動物對高脂食物更敏感，而年齡為70d～75d后的動物對高糖食物所誘導的動物體重增加敏感[19]。

高脂食物所誘導的肥胖還存在性別差異，這種差異主要表現(xiàn)為脂肪分布部位的不同。雌性動物在腹內及生殖器官周圍的脂肪墊所占比例大于雄性，而在前肢的比例較雄性小[19]。當前8頁，總共40頁。小結食源性肥胖造模以有很多成功的經驗，對肥胖模型飼料的研究至今已有約20年歷史，形成了較為成熟的方法。肥胖癥研究的混雜因素很多，除了模型飼料的脂肪水平外，還包括實驗動物品種、品系、性別、年齡等，而且約有50%的動物存在食物抵抗。所以要得到足夠數(shù)量的模型動物，實驗動物樣本的數(shù)量需放大至少1倍。當前9頁，總共40頁。糖尿病胰島素抵抗/糖尿病高果糖/蔗糖飼料對嚙齒類動物血脂水平與胰島素抵抗的影響胰島素抵抗（IR）是指胰島素靶組織對內源性或外源性胰島素的敏感性與反應性降低。IR不僅是2型糖尿病的發(fā)病基礎，并且也與肥胖、高血壓和心血管疾病等密切相關。

目前IR模型以鼠類模型為主，按照建立方法的不同可以分為遺傳性模型、基因改造模型、誘發(fā)模型，其中誘發(fā)模型由于復制成功率高、穩(wěn)定、復制方法簡單、價格低、周期短，在國內得到了廣泛應用[20]。當前10頁，總共40頁。IR常用造模動物及模型飼料序號動物飼料造成IR動物模型所需時間1[21]Wistar大鼠68%高蔗糖飼料2周2[22]倉鼠60%高果糖飼料2周3[23]Wistar大鼠，雌性脂肪40.08Kcal%，碳水化合物43.27Kcal%，蛋白質16.65Kcal%8周4[24]Wistar大鼠，雄性脂肪59Kcal%，碳水化合物20%，蛋白質21Kcal%6周5[25]SD大鼠，雌雄各半脂肪60.65Kcal%，碳水化合物25%，蛋白質14.35Kcal%6周當前11頁，總共40頁。*******注：SD大鼠，分別用對照料和不同加工方式高脂料飼喂6周后測定。Nor對照組、H1高脂料1——所用原料混勻，100oC烘烤2h；H2高脂料2——白糖+雞蛋混勻，100oC水蒸2h，再與其余原料混勻，繼續(xù)100oC水蒸2h；H3高脂料3——白糖+雞蛋混勻，100oC水蒸2h，再與其余原料混勻，100oC烘烤2h；3組高脂料配方相同[25]。糖與蛋白充分混勻并加熱的高熱量飼料更易于誘發(fā)IR美拉德反應(Maillardreaction):是還原糖的羰基與氨基酸的氨基之間在加熱時發(fā)生的非酶催化的褐變反應。該反應是法國化學家Louis-CamilleMaillard于1912年在將甘氨酸與葡萄糖混合加熱時發(fā)現(xiàn)的，也稱為羰氨反應。該反應生成一系列的的糖化產物（AGEs）。人類及動物實驗研究均表明食入AGEs的量影響血AGEs水平，而高AGEs血癥可以影響機體對胰島素的敏感性，導致IR，促進糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[25]。當前12頁，總共40頁。非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。特點是人體自身能夠產生胰島素，但細胞無法對其作出反應，使胰島素的效果大打折扣。Ⅱ型糖尿病當前13頁，總共40頁。二型糖尿病造模動物及模型飼料劉亞平[81]等2008年通過對Wistar大鼠的研究發(fā)現(xiàn)：通過給大鼠飼喂高脂高糖飼料（基礎料60%+豬油10%+蛋黃粉10%+蔗糖20%）8周，再結合小劑量注射鏈脲佐菌素（STZ，30mg/kg），可成功建立雄性大鼠2型糖尿病模型，而同等劑量，雌性模型需兩次注射STZ。雄、雌性糖尿病大鼠模型都具有高血糖、脂質代謝紊亂和胰島素抵抗的特點造模成功率及穩(wěn)定性與性別有關，雄性大鼠較雌性大鼠成模率高，穩(wěn)定性好，且耗時更短。當前14頁，總共40頁。湯球（2011）[82]在雄性SD大鼠中研究發(fā)現(xiàn)：給雄性SD大鼠飼喂高脂高糖飼料4周，第一次腹腔注射STZ30mg/kg，再過4周后第二次注射STZ40mg/kg，能夠成功制備T2DM大鼠模型，造模成功率為81.9%，死亡率為18.1%。當前15頁，總共40頁。小結食物誘發(fā)的胰島素抵抗模型復制成功率高、穩(wěn)定、可靠，同時復制方法簡單、價格低廉、周期短，在國內得到了廣泛應用。目前主要的胰島素抵抗模型飼料有：高脂飼料、高糖飼料、高脂高糖飼料。二型糖尿病造模的主要方法是：用高脂高糖飼料+小劑量的STZ注射。當前16頁，總共40頁。脂肪肝脂肪肝非酒精性脂肪肝（NAFLD）non-alcoholicfattyliverdiaease

NASH與人類肥胖癥、胰島素抵抗、血脂異常及II型糖尿病的發(fā)病密切相關[27]。大部分肥胖癥患者都伴有肝臟脂肪變性[28,29]。當前17頁，總共40頁。非酒精性脂肪肝模型動物

NAFLD動物模型采用的實驗動物主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家兔、小型豬等，但主要以大鼠造模最為常見[80]。當前18頁，總共40頁。非酒精性脂肪肝模型飼料嚙齒類動物的脂肪肝可以用飼料進行誘導。主要有3種飼料：MCD飼料（蛋氨酸-膽堿缺乏飼料）、CD飼料（膽堿缺乏飼料）和HFD飼料（高脂飼料）。當前19頁，總共40頁。給SD大鼠飼喂MCD飼料2-4周可誘導嚴重非酒精性脂肪肝表型（肝臟脂肪變性、肝炎和肝纖維化）

[30,31]；體重減少，不會引起胰島素抵抗[32,33]。MCD飼料（蛋氨酸—膽堿缺乏飼料）：MCD飼料誘導的肝臟脂肪變性的機制：蛋氨酸、膽堿缺乏磷脂酸膽堿合成減少VLDL分泌受阻甘油三酯出肝受阻脂肪浸潤肝細胞（脂肪變性）[34]MCD飼料成分的改變：果糖比葡萄糖更有效誘導小鼠的肝細胞損傷[35]。飽和脂肪比非飽和脂肪能加速肝臟脂肪氧化并誘導促炎基因表達[35]。相對于奶油，橄欖油誘導肝臟甘油三酯堆積，魚油降低肝臟膽固醇水平[36]。當前20頁，總共40頁。21給大鼠飼喂CD飼料7周后，血脂水平升高并誘發(fā)胰島素抵抗[37]。飼喂10周后，誘導肝臟脂肪變性、肝炎及肝損傷,且體重下降[37]。CD飼料（膽堿缺乏飼料）：當前21頁，總共40頁。HFD飼料（高脂飼料）：?誘導SD大鼠體重增加，體內脂肪堆積及胰島素抵抗[38]。?不能誘導肝纖維化，只能誘導輕度的肝臟脂肪變性[27]。?添加膽固醇的HFD飼料，能誘導LDLR（-/-）小鼠肝臟脂肪水平升高并產生大小泡型脂肪變性[39]。?VD缺乏的HFD飼料能使SD大鼠NAFLD惡化[40]。?在35kcal%脂肪的HFD飼料中用中鏈甘油三酯替代長鏈甘油三酯，可以阻止大鼠的肝脂肪變性[41]。?加果糖/蔗糖水的HFD飼料能誘導小鼠的肝纖維化[42]。?母體在妊娠期與哺乳期就進行HFD飼喂的小鼠后代比那些離乳后才進行HFD飼喂的小鼠對NASH的發(fā)病更加易感[43]。中鏈脂肪酸（MCFAs）比長鏈脂肪酸（LCFAs）水解能力強6倍，且MCFAs水解對膽鹽和胰酶的依賴性較低，MCFAs的吸收不經過淋巴系統(tǒng)而直接入血由肝門靜脈入肝，可以不依賴肉堿載體而直接進入線粒體氧化供能。MCFAs幾乎不參與脂肪酸的從頭合成，在體內很少沉積[91]。當前22頁，總共40頁。王倩等2007年用改良的高脂飼料（豬油10%+蔗糖5%+膽固醇2%+膽酸鈉0.5%+丙硫氧嘧啶0.2%+基礎飼料82.3%）飼喂SD大鼠5周能成功地構建非酒精性脂肪肝大鼠模型，主要表現(xiàn)為大鼠體重與對照組無顯著差異，光鏡下可見肝細胞內彌漫大量的脂肪空泡，電鏡證實肝細胞內有大量脂滴[92]。當前23頁，總共40頁。劉賀榮等2010用高脂飼料（豬油10%+膽固醇1.5%+豬膽鹽0.5%+基礎料88%）飼喂昆明小鼠6周，成功建立非酒精性脂肪肝模型。具體表現(xiàn)為小鼠肝細胞明顯腫脹，肝組織內可見彌漫分布的大脂滴和微脂滴并散布全肝[93]。當前24頁，總共40頁。小結嚙齒類動物中的大鼠、小鼠是NAFLD很好的動物模型，也是目前研究中常用的動物模型。誘導NAFLD模型的飼料主要有高脂飼料、膽堿缺乏飼料、膽堿-蛋氨酸缺乏飼料三種。2023/3/4當前25頁，總共40頁。動脈粥樣硬化動脈粥樣硬化飼料誘導的嚙齒類動物動脈粥樣硬化/高膽固醇血癥動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種復雜的慢性病，是指動脈內膜下有脂質沉積，并伴有纖維基質成分和平滑肌的細胞增殖，逐步發(fā)展形成動脈硬化性斑塊，斑塊部位的動脈壁增厚、變硬，斑塊內部的壞死組織與沉積的脂質結合，形成粥樣物質的過程[44]。當前26頁，總共40頁。模型飼料飼料誘導的嚙齒類動物動脈粥樣硬化/高膽固醇血癥動脈粥樣硬化的誘發(fā)因素之一是高膽固醇血癥（TC和LDL-C水平升高）。富含飽和脂肪（SF）與膽固醇的食物，如Western-typediets，能引起血液循環(huán)系統(tǒng)中的膽固醇（尤其LDL-C）水平升高[44]。

模型飼料：

西方飲食模型飼料。

高脂高膽固醇當前27頁，總共40頁。動物模型小鼠：誘導動脈粥樣硬化模型常用轉基因小鼠：LDLR基因缺陷小鼠與apoE基因缺陷小鼠。含膽固醇（0.15%-1.25%重量比）不含膽酸的Western-typediets能在12周后誘導LDLR基因缺陷小鼠明顯的動脈粥樣硬化病變[52]。Western-typediets誘導apoE基因缺陷小鼠出現(xiàn)動脈粥樣硬化早期病變只需6周[53]。原理：這些小鼠體內的突變體基因阻止了肝臟對血液循環(huán)系統(tǒng)中膽固醇的清除作用。當前28頁，總共40頁。動物模型大鼠：Western-typediets(45kcal%脂肪，氫化椰子油、膽固醇1%，重量比、膽酸0.25%，重量比)飼料都能誘導大鼠TC及LDL-C水平的升高[47-49]，若要誘導動脈粥樣硬化還需添加0.5%的甲狀腺激素抑制劑(2-硫脲嘧啶)[50]。SD大鼠造模開始時一次性腹腔注射VD360萬IU.kg-1，并飼喂高脂飼料（10%豬油+5%白糖+3%膽固醇+0.5%膽酸鹽+0.2%丙基硫氧嘧啶+81.3%基礎飼料）8周，可建立動脈粥樣硬化模型。但該方法造模時大鼠的體重減輕,且死亡率達53%

（周永剛等，2011）。SD大鼠飼喂高脂模型飼料（1%膽固醇+0.5%膽酸鈉+0.1%甲巰咪唑+5%豬油+93.4%基礎料）2個月可建立動脈粥樣硬化模型[84]。VD3升高血漿鈣破壞動脈內皮加速血管壁脂沉積當前29頁，總共40頁。動物模型基因突變大鼠：自發(fā)性基因突變大鼠（如JCR，LA-Corpulent）對食物中膽固醇敏感，能在沒有膽酸或甲狀腺激素抑制劑的參與下誘發(fā)高膽固醇血癥[51]。當前30頁，總共40頁。動物模型倉鼠：（含有膽固醇酯轉移蛋白CETP，而大鼠、小鼠沒有）

CETP能將HDL微粒內的膽固醇轉移至血漿LDL微粒中。

富含膽固醇（0.5%，重量比）與飽和脂肪（15-20%奶油脂肪，重量比）的西方飲食模型飼料（Western-typediets）能在沒有膽酸的參與下在6周內誘導倉鼠血漿TC和LDL-C水平的升高及明顯的動脈粥樣硬化病變[55]。當前31頁，總共40頁。動物模型豚鼠：豚鼠體內含有膽固醇酯轉移蛋白CETP[57]，西方飲食模型飼料能在沒有膽酸的參與下誘導豚鼠的膽固醇水平升高和動脈粥樣硬化[58]。豚鼠對膳食脂肪酸成分變化高度敏感，富含飽和脂肪酸SF（棕櫚仁油）的高脂料中，添加0.3%膽固醇（重量比）可誘導豚鼠TC和LDL-C水平升高，在12周后誘發(fā)動脈粥樣硬化[59-61]。高糖（42Kcal%）適度高脂（35Kcal%脂肪）高膽固醇（0.25%重量比）的飼料容易誘導豚鼠的動脈粥樣硬化[62]。當前32頁，總共40頁。小結西方飲食模型飼料誘導嚙齒類動物動脈粥樣硬化（AS）是目前廣泛應用的模式化飼料。不同嚙齒動物（如大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠、基因敲除鼠）其造模特點不同，因此應根據研究目的進行選擇并配套相應的模式化飼料。2023/3/4當前33頁，總共40頁。高血壓高血壓飼料誘導的嚙齒類動物高血壓表型人類高血壓的發(fā)病機制與遺傳、環(huán)境等多種因素相關。高血壓研究首選的動物模型是大鼠，包括選擇性培育的純合品系高血壓大鼠（自發(fā)性高血壓大鼠SHR、鹽敏感性高血壓大鼠DahlSS）與封閉群大鼠（SD大鼠）。當前34頁，總共40頁。高血壓高鈉飼料是常用的高血壓誘導飼料。LewisDahl等根據SD大鼠對8%NaCl飼料的不同響應，從選擇性近親交配的SD大鼠中培育出了Dahl鹽敏感性（DahlSS，2-6周）與Dahl鹽抵抗性（DahlSR）大鼠模型[63]。動物年齡在高血壓的鈉誘導中也起重要作用。SHR大鼠在5-6周齡就會自發(fā)性地血壓升高[64]。

在飼料中添加7%NaCl或1%生理鹽水能增加SHR大鼠的血管阻力，從而加劇SHR大鼠的血壓升高[65,66]。隨著血液循環(huán)系統(tǒng)中鈉水平的升高，細胞內的水分會在滲透壓的作用下釋放至血液循環(huán)系統(tǒng)，從而引起血管壁受壓升高當前35頁，總共40頁。攝食4%NaCl純化飼料的Dahl