分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)與產(chǎn)前診斷

關(guān)于分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)與產(chǎn)前診斷第1頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因診斷的中心問(wèn)題是認(rèn)識(shí)遺傳變異、基因突變及與表型之間的關(guān)系第2頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)第3頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光原位雜交技術(shù)（fluorescenceinsitehybridization,FISH）：用熒光物質(zhì)標(biāo)記特異性DNA探針，與中期細(xì)胞染色體或間期細(xì)胞核雜交，鑒別和確定出生缺陷、腫瘤細(xì)胞染色體異常，分辨率可達(dá)50－500kb.第4頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescenceinsitehybridization,FISH）的特異性DNA探針基因座特異性探針：克隆擴(kuò)增獲得。在基因制圖方面的努力，越來(lái)越多的這方面探針可以使用著絲粒重復(fù)序列探針：這些特異性的探針可在中期染色體和間期細(xì)胞核中產(chǎn)生強(qiáng)烈信號(hào)，可以鑒別特異性染色體。全染色體涂染探針：通過(guò)對(duì)來(lái)自特異性染色體分檢庫(kù)或僅含一條人類染色體的雜種細(xì)胞DNA擴(kuò)增制備。這種DNA序列的混合物與一條染色體上的多個(gè)位點(diǎn)同源。因此在中期核內(nèi)，整條染色體得以被涂染。通過(guò)使用不同的熒光素，在一個(gè)中期染色體涂片上可以鑒別幾條不同的染色體。第5頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三應(yīng)用15號(hào)染色體一基因特異性探針（紅色）雜交確定其是否缺失；綠色探針鑒定15號(hào)染色體著絲粒。24種不同染色體涂染探針雜交得到的彩色染色體第6頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三染色體技術(shù)的應(yīng)用－1inv(14)(p12q24)t(2;11)(2q34;11q13)第7頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞遺傳學(xué)研究中染色體技術(shù)的應(yīng)用—FISH技術(shù)檢出t(2;14)第8頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三染色體技術(shù)的應(yīng)用－2inv(9)(p12q13)第9頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分子細(xì)胞遺傳學(xué)：DMD基因第46號(hào)外顯子缺失第10頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞遺傳學(xué)研究中染色體技術(shù)的應(yīng)用9號(hào)染色體涂染探針雜交。箭頭示易位到10號(hào)染色體上的來(lái)自9號(hào)染色體的片段21號(hào)染色體涂染探針FISH雜交，顯示21三體第11頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三比較基因組雜交（comparativegenomichybridization,CGH）近年在FISH技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不同熒光物質(zhì)分別標(biāo)記腫瘤細(xì)胞DNA和正常人細(xì)胞DNA，然后與正常人中期細(xì)胞染色體雜交。通過(guò)檢測(cè)染色體上兩種熒光信號(hào)的相對(duì)比值，了解腫瘤細(xì)胞DNA拷貝數(shù)的變化，并可在染色體上定位。這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤基因組不平衡的檢測(cè)。第12頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三比較基因組雜交的原理第13頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三待測(cè)DNA（腫瘤細(xì)胞DNA，testDNA)為綠色參照DNA(正常細(xì)胞DNA，referenceDNA）為紅色復(fù)染為藍(lán)色人食管鱗癌細(xì)胞株的比較基因組雜交第14頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三中期染色體的DAPI的復(fù)染圖B.中期染色體比較基因組雜交（CGH）：紅色區(qū)域表示丟失，綠色區(qū)域表示擴(kuò)增。第15頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三CGH的優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)一次染色體原位雜交實(shí)驗(yàn)即可在整條染色體或染色體區(qū)帶水平對(duì)待檢基因組DNA序列拷貝數(shù)改變進(jìn)行檢測(cè)和定位。無(wú)需進(jìn)行染色體培養(yǎng)，對(duì)于不易制備良好分裂相的實(shí)體瘤尤為適用。所需染色體DNA可來(lái)自各種組織，如新鮮組織、福爾馬林固定的組織、石蠟包埋組織，可在很少量的基礎(chǔ)上檢測(cè)，利于做回顧性研究。第16頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三CGH的局限性：難以檢出以下異常：平衡易位，微小突變，基因重排，倍體水平改變。結(jié)果可能受到一些因素影響：正常細(xì)胞存在，腫瘤自身的遺傳異質(zhì)性，系統(tǒng)的波動(dòng)。靈敏度：限于檢測(cè)較大范圍的缺失（10—30MB）第17頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、突變分析與分子診斷第18頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（一）基因突變類型點(diǎn)突變：只有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的改變，是突變中最多見(jiàn)的形式。穩(wěn)定突變：傳遞中不改變?cè)械耐蛔儭?dòng)態(tài)突變：傳遞中不斷改變自己，多見(jiàn)于短重復(fù)序列的突變，在一代代傳遞中重復(fù)次數(shù)發(fā)生明顯變化。

第19頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三點(diǎn)突變的結(jié)果：（1）同義突變（samesensemutation）：堿基替換后，雖然密碼子發(fā)生改變，但編碼氨基酸沒(méi)有改變（遺傳密碼的兼并性），亦稱靜止突變。（2）錯(cuò)義突變（missensemutation）：堿基替換，密碼子發(fā)生改變后，編碼氨基酸亦發(fā)生改變，編碼另一個(gè)氨基酸。（3）無(wú)義突變（nonsensemutation）：堿基替換后，使編碼氨基酸的密碼子變成一個(gè)終止密碼子。（4）中性突變：包含兩種情況，即“同義突變”和不改變蛋白質(zhì)功能的“錯(cuò)義突變”第20頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因突變形式—堿基的插入和缺失堿基的插入和缺失：基因編碼序列中插入或丟失一個(gè)或幾個(gè)堿基，其結(jié)果是突變點(diǎn)下游堿基序列發(fā)生移碼，編碼氨基酸序列都發(fā)生改變，又稱移碼突變（frameshiftmutation），并可在突變點(diǎn)下游提前出現(xiàn)終止密碼。第21頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三堿基的插入和缺失的結(jié)果：將導(dǎo)致移碼突變（frameshiftmutation），并可在突變點(diǎn)下游提前出現(xiàn)終止密碼產(chǎn)生截短型蛋白缺失突變第22頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三基因突變形式框內(nèi)突變（inframemutation）：3個(gè)或是的倍數(shù)的堿基缺失或插入導(dǎo)致的突變，使基因丟失或增加1個(gè)或幾個(gè)氨基酸。DNA大片段缺失或復(fù)制（largedeletionorduplication)：幾百個(gè)bp至幾十個(gè)kb的堿基缺失或復(fù)制。第23頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三各種類型病理性突變的比例無(wú)義突變和移碼突變：60％稀有的錯(cuò)義突變：20％DNA大片段缺失或重復(fù):20％另外：可能和疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有關(guān)的大量的多態(tài)位點(diǎn)微小突變第24頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）目前常用的對(duì)已知點(diǎn)突變的分析技術(shù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）等位基因特異性（PCR）擴(kuò)增（ASA）等位基因特異性寡核苷酸雜交（

ASO）DNA芯片第25頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析當(dāng)突變影響到某一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)時(shí)，可通過(guò)酶切PCR產(chǎn)物，電泳分析:限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）第26頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.等位基因特異性（PCR）擴(kuò)增（ASA）通過(guò)設(shè)計(jì)兩個(gè)5’端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)。分別加入這兩種引物及3’端引物進(jìn)行兩個(gè)平行的PCR，分析結(jié)果。第27頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.等位基因特異性寡核苷酸雜交（

ASO）設(shè)計(jì)兩段寡核苷酸探針，其中包含發(fā)生突變的位點(diǎn)，一段與野生型鏈互補(bǔ)，一段與突變型鏈互補(bǔ)。雜交分析是否存在突變第28頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.基因芯片：SNP位點(diǎn)的檢測(cè)第29頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Microarray-basedmethodforgenotypingoffunctionalsinglenucleotidepolymorphismsusingdual-colorfluorescencehybridization.MutatRes.2004;548:97-105第30頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（三）目前常用的未知基因突變分析技術(shù)異源雙鏈體形成分析（Heteroduplexanalysis,HA）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single-strandconformationanalysis,SSCP）變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）變性高效液相色譜分析（Denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC）第31頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三體外蛋白截短實(shí)驗(yàn)（Proteintruncationtest,PTT）定量多重PCR技術(shù)（QuantitativemultiplexPCR,QM-PCR）多重探針連接依賴性擴(kuò)增技術(shù)（MultiplexLigation-dependentProbeAmplifcation,MLPA)DNA序列分析（DNAsequencing)第32頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1.異源雙鏈體形成分析（HA）由突變型和野生型DNA鏈形成的異源雙鏈DNA在其錯(cuò)配處形成一個(gè)凸起，電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷移率，從而使兩者得以分離。技術(shù)路線：PCR產(chǎn)物95C變性5分鐘，37C復(fù)性10分鐘。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（0.2%硝酸銀染色）第33頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2.變性梯度凝膠電泳（DGGE）利用不同DNA序列開(kāi)始變性時(shí)對(duì)變性劑濃度的要求不同，在變性劑濃度梯度凝膠內(nèi)電泳，野生型DNA和突變型DNA序列的差異所導(dǎo)致其變性點(diǎn)不同使兩者的電泳遷移率出現(xiàn)差異第34頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3.單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于其堿基的序列。即使只有一個(gè)堿基的不同，也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)并可引起非變性條件下的電泳遷移率的差異。技術(shù)路線：PCR產(chǎn)物95C變性5分鐘，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。條件：電泳緩沖液0.5TBE，電壓70v,4C環(huán)境下電泳過(guò)夜（0.2%硝酸銀染色）。第35頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4.體外蛋白截短試驗(yàn)（PTT）從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)基因的突變。其原理是堿基缺失和插入導(dǎo)致的移碼突變、堿基替換出現(xiàn)的無(wú)義突變均可使基因提前出現(xiàn)終止密碼，從而截短mRNA翻譯的蛋白質(zhì)。技術(shù)路線：血細(xì)胞RNAcDNART-PCR體外蛋白質(zhì)合成電泳分析截短了的蛋白質(zhì)相應(yīng)基因片段的序列分析第36頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三上游引物5’端均連接T7啟動(dòng)子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG[35S]甲硫氨酸，T7體外轉(zhuǎn)錄/翻譯體系（兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物），30℃孵育90min，完成體外蛋白質(zhì)合成。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳第37頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5.變性高效液相色譜分析（DHPLC）1995年OefnerandUnderhill首次報(bào)道DHPLC技術(shù)。其原理是在接近DNA融解溫度條件下進(jìn)行離子對(duì)反相高效液相色譜分析。DHPLC分析突變的原理：在DNA部分變性的條件下，變異型和野生型DNA可形成同源雙鏈和異源雙鏈．根據(jù)其在層析柱上保留的時(shí)間可以分辨出變異性型DNA.第38頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三用離子對(duì)反相高效液相色譜檢測(cè)DNA變異是基于同時(shí)存在同源雙鏈和異源雙鏈。異源雙鏈的檢出取決于高效液相色譜的溫度。而色譜溫度的選定與野生型DNA融解溫度（Tm）有關(guān)。DHPLC與其它突變分析技術(shù)的比較:對(duì)單個(gè)核苷酸變異的檢出率:SSCP技術(shù),約75%；DHPLC,>90%.第39頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DHPLC的優(yōu)點(diǎn)：靈敏，準(zhǔn)確；分析速度快，單個(gè)樣本的分析時(shí)間僅需幾分鐘；容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作；適用于較大樣本中基因突變的篩選。第40頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DHPLC分析：（野生型）第41頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DHPLC分析:突變型（單個(gè)堿基改變）第42頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DHPLC分析:突變型（單個(gè)堿基改變）第43頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三6.定量多重PCR技術(shù)（QuantitativemultiplexPCR，Q-M-PCR）目前各實(shí)驗(yàn)室普遍采用的突變基因分析技術(shù)對(duì)基因微小突變的檢測(cè)具有較高的敏感性，如對(duì)單個(gè)堿基改變的檢出率可達(dá)90%以上。但對(duì)于較大的DNA缺失或DNA重復(fù)產(chǎn)生的突變，如以外顯子為單位的DNA缺失，SSCP、DHPLC等均難以將其檢出。有資料表明大片段DNA缺失可占基因突變的三分之一第44頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三定量多重PCR技術(shù)要點(diǎn)：涉及至少2個(gè)基因的多個(gè)外顯子在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中一個(gè)外顯子作為參照外顯子，其余作為檢測(cè)外顯子；控制PCR循環(huán)數(shù)，使PCR產(chǎn)物的增加處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線內(nèi)；PCR產(chǎn)物于DNA測(cè)序儀電泳，其結(jié)果經(jīng)GeneScan軟件處理；第45頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三以檢測(cè)外顯子PCR產(chǎn)物與參照外顯子PCR產(chǎn)物的比值計(jì)算模版DNA相對(duì)拷貝數(shù)，確定是否存在檢測(cè)外顯子的雜合性缺失；檢出的缺失經(jīng)其它方法（長(zhǎng)片段PCR或缺失斷裂點(diǎn)測(cè)序）確認(rèn)。第46頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三7.MultiplexLigation-dependentProbeAmplifcation—MLPADenaturedgenomicDNAishybridizedwithamixtureofmorethan40probes.EachMLPAprobeconsistsoftwooligonucleotides,onesyntheticandoneM13-derived.Thetwopartofhybridizedprobesareligated.AllprobeligationproductsareamplifiedbyPCRusingonlyoneprimerpair.ElectrophoresisofPCRproductsonDNASequencerinGeneScanmodel.第47頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、遺傳性疾病的診斷第48頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三遺傳性疾病的診斷：（一）臨癥診斷（二）癥狀出現(xiàn)前的診斷（三）產(chǎn)前診斷第49頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（一）臨癥診斷根據(jù)就診患者的臨床表現(xiàn)作出（初步）判斷：疾病診斷，遺傳方式（1）癥狀、體征（2）系譜分析部分遺傳性疾病的診斷主要依賴于癥狀、體征對(duì)于同時(shí)存在散發(fā)病例和遺傳性病例的復(fù)雜性疾病，如腫瘤，建立相應(yīng)的臨床可疑病例的判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)不同的遺傳性疾病，選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室技術(shù)分析確診：生化技術(shù)、細(xì)胞技術(shù)、分子技術(shù)多用于對(duì)先證者的診斷第50頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三Pedigreeofafamily第51頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三遺傳性疾病基因診斷程序臨床診斷和確定分析對(duì)象確定分析的目標(biāo)基因以檢測(cè)目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)確定分析的技術(shù)構(gòu)成和分析過(guò)程：基因微小變異篩查：SSCP,DGGE,DHPLC,PTT,DNA測(cè)序分析基因大片段變異（缺失或重復(fù)）的分析檢出變異的性質(zhì)評(píng)估和患者家族的遺傳咨詢。

第52頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DHPLC突變分析第53頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期三體外蛋白截短試驗(yàn)

（PTT）—HNPCC遺傳性突變第54頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，