堿基序列標(biāo)記法結(jié)合焦磷酸測序測定不同來源基因表達(dá)量

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源基因表達(dá)量作者：張曉丹武海萍陳之遙周國華【摘要】建立了一種將序列標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)與焦磷酸測序技術(shù)結(jié)合的相對基因表達(dá)量測定法(簡稱“SRPP”)。先用來源特異性引物對不同來源的同一基因通過反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記上特異性標(biāo)簽，PCR后用焦磷酸測序法對擴增產(chǎn)物進行序列解碼，使得測序結(jié)果中的序列代表基因的來源，峰高代表基因在不同來源中的相對表達(dá)量。用實時熒光定量PCR法對本方法的準(zhǔn)確性進行了驗證，結(jié)果表明，SRPP可以同時準(zhǔn)確測定同一基因在3個不同來源中的表達(dá)量，并實際測定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表達(dá)量差異。【關(guān)鍵詞】序列標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄,聚合物鏈反應(yīng)，焦磷酸測序，基因表達(dá)1引言差異表達(dá)基因與疾病密切相關(guān)，深入研究可在基因水平揭示疾病的發(fā)病機制。目前，用于檢測基因表達(dá)水平的技術(shù)主要有SAGE法［1］、實時熒光定量PCR法［2,3］和基因芯片法［4］等。但這些方法存在儀器設(shè)備昂貴、定量性能差以及同時測定基因表達(dá)量的來源數(shù)目受限等缺點。焦磷酸測序技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種基于酶催化化學(xué)反應(yīng)的測序技術(shù)［5?8］,不需要使用熒光標(biāo)記，定量性能好。目前，焦磷酸測序技術(shù)多用于單核甘酸多態(tài)性（SNP）分析、微生物分型和基因甲基化分析等。本研究將焦磷酸測序技術(shù)用于基因表達(dá)量差異的比較分析，考察了其可行性和準(zhǔn)確性，并將其應(yīng)用于檢測Egd基因在糖尿病、肥胖癥和正常小鼠中的差異表達(dá)。2實驗部分儀器、試劑與材料21R型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）;GeneSpe田微量核酸蛋白測定儀（日本NakaInstrument公司）;PTC225PCR擴增儀、Opticon實時熒光PCR儀（美國^^Research公司）。焦磷酸測序裝置由本實驗室自行組裝［9,10］。此裝置主要由焦磷酸測序反應(yīng)模塊、熒光信號放大和數(shù)據(jù)采集3部分組成。反應(yīng)模塊由位于中間的反應(yīng)池通過毛細(xì)管與四周的dNTP儲液池相連組成。通過注射器施壓使4種dNTP循環(huán)加入反應(yīng)池完成測序反應(yīng)。熒光信號通過R6335光電倍增管（日本HamamatsuPhotonicsK.K.公司）放大后，經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測量儀（北京中國科學(xué)院生物物理研究所）采集數(shù)據(jù)。HotstarTaqDNA聚合酶、OmniscriptRTkit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Qiagen公司）;Trizol（上海Inviotrogen公司）;熒光素、熒光素酶、三磷酸腺甘硫酸化酶、三磷酸腺甘雙磷酸酶和5'磷酸化硫酸腺甘（美國Sigma公司）；DynabeadsM280鏈霉親和素磁珠（挪威DynalAS公司）；KlenowDNA聚合酶（美國Promega公司）;所有引物均由上海Invitrogen公司合成。實驗中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝組織由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。RNA的提取用Trizol試劑盒抽提RNA,用紫外分光光度法測定RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈取等量的不同來源的總RNA,分別以來源特異性反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。即取總RNA0.05?2.0圖至Nuclease free的小管中，力口DEPCH2O至12匹;65℃反應(yīng)5min后，置冰上至少1min;在上述各小管中加入10X第一鏈合成緩沖液2匹，0.5mmol/LdNTP混合物，10URNase抑制齊心200UOmnisc