熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座

熒光免疫層析技術(shù)原理與進(jìn)展熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第1頁(yè)熒光免疫層析技術(shù)基本原理層析法(chromatography)原理是利用混合物中各組分物理性質(zhì)之差(如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等)而建立來(lái)一個(gè)分離技術(shù)。層析系統(tǒng)是由固定相(stationaryphase)和流動(dòng)(MobilePhase)相組成。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第2頁(yè)固定相是固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)上成份。流動(dòng)相是能夠流動(dòng)物質(zhì)，如水或各種溶劑。層析過(guò)程：當(dāng)待分離混合物隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，因?yàn)榛旌衔锔鹘M分理化性質(zhì)差異，與固定相相互作用弱組分隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到阻滯作用小，向前移速度快；與固定相相互作用強(qiáng)組分向前移動(dòng)速度慢。從而實(shí)現(xiàn)混合物中各組分分離。

熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第3頁(yè)

免疫層析法免疫層析技術(shù)是建立在層析技術(shù)和抗原一抗體特異性免疫反應(yīng)基礎(chǔ)上一項(xiàng)新興免疫檢測(cè)技術(shù)。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第4頁(yè)免疫層析技術(shù)以固定有檢測(cè)線和控制線條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)毛細(xì)作用使待測(cè)物在層析條上移動(dòng)。待測(cè)物在T線處發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。游離物在C線處發(fā)生免疫反應(yīng)。待測(cè)物層析方向免疫反應(yīng)TC免疫層析技術(shù)基本原理示意圖熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第5頁(yè)熒光（fluorescence）

熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。

發(fā)射光譜和激發(fā)光譜發(fā)射光譜是指固定激發(fā)波長(zhǎng)，在不一樣波長(zhǎng)下統(tǒng)計(jì)樣品發(fā)射熒光強(qiáng)度。激發(fā)光譜是指固定檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)，用不一樣波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)樣品統(tǒng)計(jì)對(duì)應(yīng)熒光發(fā)射強(qiáng)度。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第6頁(yè)熒光效率定義:熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光百分率計(jì)算公式:

熒光效率=

熒光壽命定義:熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生熒光衰減到一定程度時(shí)所用時(shí)間。各種熒光物質(zhì)熒光壽命不一樣。

熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第7頁(yè)熒光淬滅定義:熒光物質(zhì)在一些理化原因作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。引發(fā)熒光淬滅原因：有如紫外線照射、高溫、一些硝基化合物、重氮化合物等。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第8頁(yè)免疫層析技術(shù)以固定有檢測(cè)線和控制線條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)毛細(xì)作用使待測(cè)物在層析條上移動(dòng)。待測(cè)物在T線處發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。游離物在C線處發(fā)生免疫反應(yīng)。待測(cè)物層析方向免疫反應(yīng)TC免疫層析技術(shù)基本原理示意圖熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第9頁(yè)熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第10頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)法待測(cè)物中某種抗原與T（檢測(cè)線）線處同種抗原競(jìng)爭(zhēng)性地與標(biāo)識(shí)抗體相結(jié)合過(guò)程。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第11頁(yè)

競(jìng)爭(zhēng)法含抗原AY1:A單抗與標(biāo)識(shí)物偶聯(lián)體Y2：抗原AY3:羊抗鼠二抗結(jié)合墊免疫層析法檢測(cè)實(shí)物圖熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第12頁(yè)夾心法待測(cè)物中某種抗體（抗原）與T線處抗原A（抗原A）以及熒光標(biāo)識(shí)抗原（抗體）特異性相結(jié)合過(guò)程，在T線處形成抗體A+抗原+抗體B形式夾心結(jié)構(gòu)。結(jié)合墊免疫層析法檢測(cè)實(shí)物圖熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第13頁(yè)雙抗體夾心法(k)Ab1-Ag-Ab2(k)Ab1(k)Ab1-AgAb2Ab3-(k)Ab1TC陽(yáng)性結(jié)果T,C都有顏色待測(cè)液含抗原Ag待測(cè)液，不含抗原Ag(k)Ab1(k)Ab1(k)Ab1Ab2TCAb3-(k)Ab1陰性結(jié)果T無(wú)顏色，C有顏色雙抗體加心法檢測(cè)原理圖K代表某一標(biāo)識(shí)物結(jié)合墊免疫層析法檢測(cè)實(shí)物圖熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第14頁(yè)雙抗原夾心法雙抗原夾心反應(yīng)模式陽(yáng)性檢測(cè)（左）與陰性檢測(cè)（右）熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第15頁(yè)利用熒光免疫層析試紙條能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)待測(cè)物定性或者定量檢測(cè).熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第16頁(yè)熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第17頁(yè)金顆粒之間存在靜電斥力使其在水中保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，形成穩(wěn)定水溶性膠體，即稱為膠體金膠體金熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第18頁(yè)膠體金現(xiàn)有明亮色彩，又有高電子密度，能夠吸附生物大分子，且不影響生物分子活性，故可作為生物分子標(biāo)志物，用于免疫反應(yīng)中抗原或抗體標(biāo)識(shí)定位，定性甚至定量研究。層析試紙標(biāo)識(shí)用金顆粒直徑大多在20～40nm，呈深紅色。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第19頁(yè)膠體金標(biāo)識(shí)蛋白質(zhì)過(guò)程是蛋白被動(dòng)吸附到金顆粒表面過(guò)程。因?yàn)榈鞍追肿永慰康亟Y(jié)合在金顆粒表面，形成一個(gè)蛋白層，阻止了膠體金顆粒相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第20頁(yè)膠體金作為標(biāo)志物有以下優(yōu)勢(shì):①幾乎可標(biāo)識(shí)全部蛋白分子，過(guò)程簡(jiǎn)單，效率高，用量少，廉價(jià)，基本不改變被標(biāo)識(shí)蛋白活性。且穩(wěn)定，無(wú)毒，使用方便，保質(zhì)期長(zhǎng)。②不一樣直徑納米金能夠用于多重標(biāo)識(shí)。③結(jié)果判斷只需普通光學(xué)儀器或直接肉眼觀察。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第21頁(yè)膠體金作為標(biāo)識(shí)物應(yīng)用熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第22頁(yè)試孕紙熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第23頁(yè)熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第24頁(yè)應(yīng)用（定量）08天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院與天津市進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局合作開發(fā)研發(fā)一個(gè)便攜式儀器。競(jìng)爭(zhēng)法原理用于農(nóng)藥殘留定量檢測(cè)熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第25頁(yè)2鑭系元素鑭系元素又稱為稀土金屬元素，指元素周期表中原子序數(shù)57～71全部元素。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第26頁(yè)兩種不一樣鑭系元素離子(分別作為光吸收子和發(fā)射子)摻雜入亞微米尺寸陶瓷顆粒(作為主基質(zhì))中，會(huì)組成一類能上轉(zhuǎn)發(fā)光產(chǎn)生熒光特殊材料?！猆CP(up-convertingphosphor，UCP)顆粒。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第27頁(yè)UCP顆粒主要含有以下三種成份:主基質(zhì)：氧硫化物（Y2O2S,GdO2S）、氟化物(YF3,GdF3）、硅酸鹽(YSi2O5,YSi3O7）...吸收子Yb3+Er3+Sm3+發(fā)射子Er3+Ho3+Tm3+

A2S1S2A1A3熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第28頁(yè)UCP獨(dú)特優(yōu)勢(shì)①高敏感性，有報(bào)道UCP靈敏度可達(dá)膠體金100倍。②高穩(wěn)定性，UCP發(fā)光信號(hào)不受檢測(cè)環(huán)境或樣品腐蝕或標(biāo)志物本身衰變等影響，可長(zhǎng)久存放和可重復(fù)。③使用簡(jiǎn)便，安全無(wú)毒，可適合用于定量分析與多重分析，在普通試驗(yàn)室或野外現(xiàn)場(chǎng)都可輕松應(yīng)用.熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第29頁(yè)中科院報(bào)道了一個(gè)用于免疫活性檢測(cè)UCP試紙條讀數(shù)計(jì)，采取半導(dǎo)體激光器作為光源，CCD作為光電接收器，步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)控制試紙條移動(dòng)裝置UCP應(yīng)用舉例熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第30頁(yè)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制出一個(gè)UPT十通道免疫層析試紙盤，同時(shí)檢測(cè)各種抗體以確證是否感染鼠疫菌熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第31頁(yè)霍亂弧菌—霍亂—烈性腸道傳染病甲胎蛋白(AFP）-肝癌特異性指標(biāo)。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第32頁(yè)3量子點(diǎn)量子點(diǎn)(quantumdots，QDs)，主要指主族Ⅱ～Ⅵ(如CdSe)，Ⅲ～Ⅴ(如InP、InAs、GaSe)，副族化合物以及Si等元素組成納米顆粒熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第33頁(yè)①Q(mào)Ds有可準(zhǔn)確調(diào)諧發(fā)射波長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)調(diào)整粒子尺寸可得到不一樣發(fā)射光譜，即可使用大小不一樣同種QDs顆粒實(shí)現(xiàn)不一樣顏色標(biāo)識(shí)。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第34頁(yè)②較大Stokes位移和狹窄對(duì)稱熒光譜峰。使得用同一激發(fā)光源可同時(shí)激發(fā)不一樣大小量子點(diǎn)，產(chǎn)生不一樣發(fā)射光譜，使同時(shí)檢測(cè)多樣本成為可能。③QDs熒光性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)久保留，經(jīng)受重復(fù)屢次激發(fā)。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第35頁(yè)④生物相容性好物理結(jié)合

化學(xué)偶聯(lián)熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第36頁(yè)量子點(diǎn)是一個(gè)新熒光標(biāo)識(shí)物，當(dāng)前在免疫層析中得應(yīng)用相對(duì)UCP，膠體金較少見(jiàn)報(bào)道。張國(guó)華，賴衛(wèi)華等，量子點(diǎn)標(biāo)識(shí)免疫層析試紙條快速檢測(cè)萊克多巴胺研究[J]，，以CdSe為標(biāo)識(shí)物，對(duì)萊克多巴胺(一個(gè)苯酚胺類β-腎上腺素激動(dòng)劑)快速定量檢測(cè)。胡華軍，付濤等，CdTe/ZnSe核殼量子點(diǎn)免疫層析試紙條檢測(cè)克倫特羅研究，,檢測(cè)克倫特羅(Clenbuterol，CLE)—屬于β-興奮劑類藥品,又稱“瘦肉精”量子點(diǎn)在免疫層析中應(yīng)用熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第37頁(yè)4有機(jī)納米粒子熒光素衍生物等熒光染料類有機(jī)納米粒子是早期慣用于免疫層析技術(shù)中一大類標(biāo)志物，如異硫氰酸酯熒光素，標(biāo)識(shí)原理基本都是利用熒光分子中異硫氰酸根為反應(yīng)基團(tuán)，與蛋白分子中氨基結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白標(biāo)識(shí)，同時(shí)以分子中熒光素為檢測(cè)信號(hào)，早期應(yīng)用研究較多。有機(jī)納米粒子熒光發(fā)射依賴于粒子本身化學(xué)發(fā)光集團(tuán)不含有沒(méi)有機(jī)納米粒子波長(zhǎng)可調(diào)控尺寸效應(yīng)。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第38頁(yè)5納米磁性顆粒納米磁性顆粒(magneticnanoparticle，MNs)也被稱為超順磁顆粒，它結(jié)合了磁性粒子和納米材料優(yōu)點(diǎn)，含有粒徑小、超順磁性和比表面積大等特征。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第39頁(yè)經(jīng)典是以磁性材料四氧化三鐵.表面引入活性基團(tuán)，經(jīng)過(guò)耦聯(lián)反應(yīng)與酶、抗體等生物分子結(jié)合形成生物標(biāo)志物.超順磁性.熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第40頁(yè)6碳納米管碳納米管(carbonnanotubes，CNTs)結(jié)構(gòu)可看成是石墨六角形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)發(fā)生一定彎曲而形成空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。熒光免疫層析技術(shù)原理進(jìn)展宣講專家講座第41頁(yè)CNTs作為生物分子標(biāo)志物原理與膠體金類似，其顯著黑色在定