細胞程序性死亡與細胞衰老課件

第十三章程序性細胞死亡與細胞衰老第一節(jié)程序性細胞死亡一個主動的有基因決定的自動結(jié)束生命的過程。由于受到嚴格的由遺傳機制決定的程序性調(diào)控，所以常常被稱為細胞程序性死亡（programmedcelldeath,PCD）機體結(jié)構(gòu)細胞增殖細胞分化細胞凋亡細胞信號轉(zhuǎn)導染色體（DNA與蛋白質(zhì)的相互作用）衰老凋亡小體的形成：染色質(zhì)斷裂成大小不等的片段，與某些細胞器（線粒體）聚集在一起，被反折的質(zhì)膜包圍，形成凋亡小體，從外觀上看，細胞表面發(fā)泡，產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，隨后逐漸分離，形成凋亡小體。凋亡小體被臨近的細胞或體內(nèi)吞噬細胞所吞噬,殘余物質(zhì)被消化后重新利用。整個過程最大的特點是質(zhì)膜始終保持完整，內(nèi)含物不發(fā)生細胞外泄露，不引發(fā)機體的炎癥反應。Morphologichanges:

Early:Chromosomecondensation,cellbodyshrinkLater:BlebbingandNucleusandcytoplasmfragment—ApoptoticbodiesAtlast:Phagocytosed染色質(zhì)聚集分塊胞質(zhì)凝縮染色質(zhì)集聚細胞器腫脹線粒體變?yōu)樾鯛詈似扑樾纬傻蛲鲂◇w

破裂內(nèi)含物釋放炎癥被吞噬消化終有膜封閉不引起炎癥ApoptosisNecrosisDeathbyapoptosisisaneat,orderlyprocess意義：細胞凋亡對于多細胞生物的個體發(fā)育的正常進行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關鍵的作用1）清除有機體不再需要的細胞，而不引起炎癥反應。2）細胞的自然更新，清除被病原體感染的細胞3）免疫細胞對靶細胞的攻擊并引起死亡，也是基于細胞凋亡4）細胞凋忘失調(diào)會導致疾病2002年諾貝爾生理與醫(yī)學獎獲得者◆2002年的諾貝爾生理學和醫(yī)學獎授予了在器官發(fā)育和程序性細胞死亡研究領域中做出奠基性貢獻的3位科學家:●英國的SydneyBrenner、美國的H.RobertHorvitz、英國的JohnE.Sulston●他們創(chuàng)造性地用線蟲作為實驗模型,實現(xiàn)了對器官發(fā)育過程中細胞分裂、分化的原位觀察,完成了細胞圖譜的繪制,●在此基礎上發(fā)現(xiàn)并研究了調(diào)控器官發(fā)育程序性細胞死亡的關鍵基因及其功能并進一步在高等哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了相關功能基因。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.SulstonApoptosisinducedbyCytoCLane1．0h2．1h3．2h4．3h5．4h6．Control7．Marker

2.0kbp1.00.50.2180~200bpDNAladder細胞凋亡的檢測方法形態(tài)學觀測：臺盼藍、DAPI、Giemsa，DNA電泳，TUNEL測定法，彗星電泳法，流式細胞分析細胞凋亡的分子機制Earlyresearches(MIT:RobertHorrid,1986)C.

elegans:1090cells,

TheFindingofCED3mutantWithoutlosinganyoftheircellstoapoptosis.CED3geneplayacrucialroleintheprocessofapoptosis.Celegans:amillimeterlong,transparentbodyonlyafewcelltypes,fromzygotetomatureadultonlyin3.5days.131cellsdeath.誘導細胞凋亡的因子:物理因子:射線、較溫和的溫度刺激化學及生物因子：活性氧基團和分子、鈣離子載體、維生素K、視黃酸、細胞毒素、DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑、正常生長因子的失調(diào)及凋亡因子的處理。

Apoptosisiscarriedoutbyaproteolyticsystem—

caspase

(1)Whycalledcaspase?Activesite:CysteineCleavagesite:Asparaticacid

CysteineAsparaticacidspecificproteaseAps-Xxx天冬氨酸特異性的半光氨酸蛋白水解酶,負責選擇性的切割某些蛋白質(zhì),切割的結(jié)果是使其活化或失活,非完全降解.分為兩類,一類為凋亡的起始者,一類為凋亡的執(zhí)行者.Caspase依賴性的細胞凋亡Apoptosiscanbedividedintotwophases：Activationphase：Thecellrespondsto“deathsignals”thatcommitittoundergoingself-destruction.Executionphase：

Thedeathsentenceiscarriedout.Apoptosiscellsarerecognizedbyphagocytesbecausetheycarryexposedmarkers,called“eatme”signals.Thebeststudied“eatme”signalisthepresenceofphosphatidylserinemoleculesintheouterleafletofPMofapoptoticcells(byflop-flipase).ProcaspasesareactivatedbybindingtoadaptorproteinsThecaspasecascadeinvolvedinapoptosisProcaspaseactivationbyproteolyticcleavage.CaspasecascadeThetargetproteinsofcaspasearethefollowing:

Morethanadozenproteinkinase,includingFAK,PKC,andRaf1.FAK–disruptcelladhesionfortheapoptoticcell.Lamins.Cleavageoflaminsleadstothedisassemblyofthenuclearlaminaandshrinkageofthenucleus.Proteinsrequiredforcellstructure.SuchasIF,actin,andgelsilin.Cleavageandinactivationoftheseproteinsleadtochangesincellshape.

Inducecelldisplaysignalsmarkeditforphagocytosis.TheinhibitorofCAD(Caspase-activatedDnase,anendonuclease).CleavageofCAD

inhibitorleadtoactivationofCAD,onceactivated,CADtranslocatesfromthecytosoltothenucleusseveringDNAintofragments.EnzymesinvolvedinDNArepair.

Whichareinactivatedbycaspasecleavage.DNArepairisahomeostaticactivitythatisinappropriateinanapoptoticcell.Caspase依賴性細胞凋亡的兩條途徑：由死亡受體起始的外源途徑：死亡配體主要是腫瘤壞死因子家族成員由線粒體起始的內(nèi)源途徑：細胞色素c(1)

Extrinsicpathway:FasSignalingPathwayFas(alsocalledApo-1orCD95)isamemberofthetumornecrosisfactorreceptor(TNFR)superfamily.Receptor-mediatedpathwayofapoptosisBcl-2Family(cytoplasmicfactors):Bad,Bid,andbax:promoteapoptosis;Bcl-X,Bcl-w,andBcl-2:preventapoptosis.Internalstimuli:DNAdamage,highCa2+,Oxidativestress死亡受體(TNFR)：TNF/NGF受體超家族，胞外段具有半光氨酸富集的重復區(qū)；TNFR-1和Fas的胞內(nèi)段含68Aa的死亡結(jié)構(gòu)域(deathdomain,DD)死亡信號(deathligands):TNF超家族（TNF,CD5/Fas…..）接頭蛋白（Adaptor）:FADD(Fasassociatedproteinwithdeathdomain)；TRADD(TNFRassociateddeathdomain);AdaptorN端的DED(deatheffectordomain):誘導caspase8活化。Apaf-1:

(apoptoticprotease-activatingfactor)線粒體途徑的胞質(zhì)蛋白，含3個功能域：

N端85Aa,稱CARD(caspaserecruimentdomain);ced-4同源區(qū)（320Aa）;C端，介導蛋白與蛋白相互作用。Caspase非依賴性的細胞凋亡:凋亡誘導因子,限制性內(nèi)切核酸酶G細胞凋亡的調(diào)控細胞中存在Caspase抑制因子,能夠直接與Caspase活性分子結(jié)合,阻止對底物的切割作用細胞存活因子(有絲分裂原和生長因子)NF-kB,抗凋亡,促存活.p53,促凋亡病毒抑制凋亡（二）細胞壞死?是細胞受到急性強力傷害時立即出現(xiàn)的反應。?早期表現(xiàn)為細胞膜破壞，線粒體腫脹。?繼而溶酶體破裂,細胞內(nèi)容物流出,引起炎癥。?細胞凋亡的一種替補方式。（三）細胞自噬個體遭遇營養(yǎng)危機時，是細胞凋亡的一種補充途徑二.植物細胞與酵母細胞的程序性死亡衰老（aging，senescence，senility）：又稱老化，通常指生物發(fā)育成熟后，在正常情況下隨著年齡的增加，機能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性下降，結(jié)構(gòu)中心組分退行性變化，趨向死亡的不可逆的現(xiàn)象。衰老和死亡是生命的基本現(xiàn)象，衰老過程發(fā)生在生物界的整體水平、種群水平、個體水平、細胞水平以及分子水平等不同的層次。生命要不斷的更新，種族要不斷的繁衍。而這種過程就是在生與死的矛盾中進行的。至少從細胞水平來看，死亡是不可避免的。第二節(jié)細胞衰老（cellularaging;cellsenescence）一、早期的細胞衰老研究（細胞“不死性”觀點）1、100年前，魏斯曼曾提出種質(zhì)不死而體質(zhì)會衰老和死亡的學說（將原生動物的衰老除外），但原生動物的“不死性”也是不成立的，因為新細胞中存在著老化的結(jié)構(gòu)成分。2、Carrel和Ebeling宣稱培養(yǎng)的雞心臟細胞可以無限制地生長和分裂（已連續(xù)培養(yǎng)34年）認為細胞本身不會衰老,衰老是由于環(huán)境的影響造成的。（后來Hayflick認為Carrel每次向培養(yǎng)基中加入的雞胚提取物中可能混有新鮮的細胞）3、20世紀40-50年代，L系小鼠細胞和Hela細胞系的建立使細胞不死性的觀點更加鞏固。（L系小鼠細胞和Hela細胞系是不正常的細胞）二、Hayflick界限（細胞增殖能力和壽命有限的觀點）60年代初，Hayflick等人的出色工作提出了細胞增殖能力和壽命有限的觀點，同時發(fā)現(xiàn)物種壽命和培養(yǎng)細胞壽命之間存在著確切的相互關系。Hayflick界限：細胞,至少是體外培養(yǎng)的細胞，不是不死的，而是有一定壽命的，它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限。（適用于很多種類型的細胞）1961，Hayflick&Moorhead報告：人成纖維細胞培養(yǎng)只能傳代40～60次。該結(jié)果后來被其他研究者所證實。細胞的增殖能力和供體的壽命正相關：Hayflick：胎兒的肺成纖維細胞可傳50代，成人的只能傳20代。Galapagos龜：壽命175歲，傳代90-125次；小鼠：壽命：3.5歲，傳代14-28次。Goldstein：兒童早老癥（Hutchinson-GilfordSyndrome）患者的成纖維細胞體外培養(yǎng)只能傳代2～4次（壽命只有12-18歲）。Werner’sSyndrome患者具有類似現(xiàn)象。Werner'ssyndrome頭發(fā)灰色、細弱、鷹鉤鼻。Werner'ssyndrome(aJapanese)14歲48歲Hutchinson-Gilfordsyndromeprogeriadisease體外培養(yǎng)細胞的衰老控制決定因素在細胞內(nèi)部：Hayflick老年男性的細胞和年輕女性的細胞（間期有Barrbody)混合培養(yǎng)：年輕女性的細胞傳代次數(shù)多。（培養(yǎng)環(huán)境相同）細胞核決定了細胞衰老：Wright&Hayflick老年胞質(zhì)體＋年輕細胞核：雜交細胞分裂能力強；年輕胞質(zhì)體＋老年細胞核：雜交細胞分裂能力弱。三、細胞在體內(nèi)條件下的衰老1、在機體內(nèi)，細胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生；2、衰老動物體內(nèi)，細胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長；3、衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細胞的增殖和衰老；四、細胞衰老的特征1、形態(tài)變化細胞核體積增大；核膜內(nèi)折；染色質(zhì)固縮化rER減少（尼氏體消失）線粒體數(shù)量減少，體積增大

致密體densebody積累又叫脂褐質(zhì)、老年色素、殘體、血褐質(zhì)等。來自溶酶體和線粒體膜系統(tǒng)：流動性下降，常處于凝膠相或固相。間隙連接減少，組成間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小。2、分子水平的變化衰老細胞會出現(xiàn)脂類、蛋白質(zhì)和DNA等細胞成分損傷，細胞代謝能力降低五、細胞衰老的分子機制（原因及假說）90年代以來，細胞衰老分子機制研究的重大進展：單基因的突變導致壽命的顯著延長；端粒和端粒酶與細胞衰老關系的發(fā)現(xiàn)等。60年代起開始出現(xiàn)的一系列衰老理論：1、氧化性損傷學說（自由基理論）Harman50年代（1956）提出。認為代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團或分子（reactiveoxygenspecies,ROS）引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子的氧化性損傷的累積，引起細胞功能的多方面異常。正常細胞內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等。根據(jù)該理論：清除ROS，就可以減緩衰老。超級表達SOD和過氧化氫酶的轉(zhuǎn)基因果蠅的壽命延長了34%;將人的SOD基因轉(zhuǎn)入果蠅體內(nèi)，其壽命延長一倍。反例：將小鼠的谷胱苷肽過氧化物酶或SOD酶剔除一種，并未引起細胞衰老的加速。2、端粒與衰老Harley,1990發(fā)現(xiàn)端粒的長度確實與衰老有著密切的關系，提出細胞衰老的“有絲分裂鐘”學說。端粒長度隨細胞衰老過程而逐漸縮短，但端粒酶卻可維持端粒的長度。

實驗證據(jù)1：1990，Harley等人發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)端粒長度隨人的年齡增長而縮短；體外培養(yǎng)的細胞中，端粒長度隨分裂次數(shù)增加而減小。實驗證據(jù)2：1998，Wright等人，將人的端粒酶基因轉(zhuǎn)入人的2n的體細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞端粒長度增加，分裂旺盛，細胞衰老指標的酶含量降低，細胞壽命延長20代。疑問1：1998，Carman，2n倉鼠的胚細胞，始終表達端粒酶，端粒長度恒定，但20～30代后仍進入衰老。疑問2：某些小鼠終生具有較長的端粒，但壽命并無明顯延長；剔除其短粒酶基因后也未表現(xiàn)出早衰癥狀。。3、rDNA與衰老：酵母染色體外rDNA環(huán)（ERC）的積累，導致細胞衰老。4、沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復合物與衰老：Sircomplex（silencinginformationregula