環(huán)境中微生物檢測方法

環(huán)境中微生物檢測方法微生物體積小、重量輕，因此可以到處傳播以致達到“無孔不入”的地步。微生物種類繁多，對外界環(huán)境的適應能力又很強，只要生活條件合適，它們就可以迅速繁殖起來。因此，它們是自然界分布最廣的一群生物無論是南極、北極、高山、海洋、陸地、淡水，還是土壤、空氣、動植物體內(nèi)外，幾乎到處都有它們的蹤跡。空氣、水是維持人類生命不可或缺的物質(zhì)。它們直接進入人體或與人接觸。如果帶有病原微生物，將成為傳染疾病的媒介。通過空氣和水中微生物的檢驗，對環(huán)境質(zhì)量進行控制。土壤中的微生物土壤是微生物生活的良好環(huán)境在自然界，土壤是微生物生活的良好環(huán)境。因為土壤具有微生物生長繁殖所必需的各種環(huán)境條件。1.1.1.1營養(yǎng)土壤中有大量動植物殘體、植物根系的分泌物、人和動物的排泄物，這些有機物為微生物提供了良好的碳源、氮源和能源；土壤中豐富的礦質(zhì)元素可以滿足微生物對礦質(zhì)營養(yǎng)的要求。1.1.1.2水分和滲透壓土壤中具有一定的持水性，可為微生物提供水分；土壤的滲透壓對微生物是等滲或低滲環(huán)境，有利于微生物攝取營養(yǎng)。1.1.1.3空氣土壤團粒結(jié)構(gòu)中的小孔隙充滿空氣，土壤中氧的含量比大氣少，平均為土壤空氣體積的7%-8%。通氣良好的土壤，氧的含量高些，有利于好氧微生物的生長。1.1.1.4pH值土壤的pH多接近中性，且緩沖能力強，適合大多數(shù)微生物生長的需要。在酸性或堿性的土壤中，亦有與之適應的微生物生長繁殖。1.1.1.5溫度土壤還具有保溫性，與空氣相比，晝夜溫差和季節(jié)溫差要小得多。即使冬季地面凍結(jié)，一定深度的土壤中仍保持一定的溫度。一般是10?25°C，適宜多種微生物生長的需要。土壤微生物的種類、數(shù)量及其分布土壤中微生物的種類和數(shù)量都很多。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類型季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。如有機物含量豐富的黑土、草甸土等肥沃土壤，微生物含量較高，每克土可含幾億至幾十億個微生物；而紅壤棕鈣土、鹽土等貧瘠土壤，微生物的含量很少，每克土也含幾百萬至幾千萬個微生物。1.1.2.1微生物種類和數(shù)量土壤這中的微生物有細菌、放線菌、真菌、藻類和原生動物等類群。其中細菌數(shù)量最多，放線菌和真菌次之，藻類和原生動物等的數(shù)量較少。（1）細菌約占土壤微生物總數(shù)的70%~90%，含量達每克土幾百萬個至幾億個，主要是異養(yǎng)型種類，少數(shù)為自養(yǎng)型。異養(yǎng)型種類積極參與土壤有機質(zhì)的分解和腐殖質(zhì)的合成。自養(yǎng)型種類轉(zhuǎn)化著礦質(zhì)養(yǎng)分的存在狀態(tài)。土壤中常見的細菌有固氮細菌、氨化細菌、硝化細菌、反硝化細菌、硫酸還原細菌、纖維素分解菌、假單胞菌、黃桿菌、鉀細菌和鐵細菌等。（2）放線菌約占土壤微生物總數(shù)的5%~30%，含量為每克土幾千萬至幾億個孢子。在偏堿性土壤中數(shù)量較多，都是異養(yǎng)型種類。放線菌較耐干旱，在潮濕土壤中比干旱土壤中少，在漬水條件下，如土壤持水量在80~100%時，放線菌很少出現(xiàn)。土壤中常見種類有諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬和小單孢菌屬。（3）真菌每克土壤中有真菌幾千至幾十萬個，均為嚴格好氧的異養(yǎng)型種類。酵母菌的含量較少，一般為每克土壤幾個到幾千個。但在葡萄園和果園的土壤中，每克土壤酵母菌含量可達幾十萬個。真菌中的霉菌，以絲狀體的菌絲交織曼延在土壤中起改良土壤團粒結(jié)構(gòu)的作用。土壤中最常見的霉菌有青霉、曲霉、枝孢霉、頭孢霉等。（4）藻類土壤中藻類的數(shù)量不多，不到微生物總數(shù)的1%，但分布卻很普遍。一般生長在土壤表層，多為單細胞綠藻和硅藻。藻類為光合型微生物，受陽光及水分影響較大，土壤下層因無陽光，數(shù)量少。在溫暖季節(jié)中，積水的土面上藻類大量發(fā)育，其中主要有衣藻、小球藻、絲藻及各種硅藻，水田內(nèi)則發(fā)育有水綿等絲狀綠藻，為土壤積累有機質(zhì)。（5）原生動物在不同類型的土壤中數(shù)量變化很大，每克土壤有幾十個至幾十萬個，在富含有機質(zhì)的土壤中主要有纖毛蟲、鞭毛蟲、肉足蟲等，大多數(shù)種類是異養(yǎng)型的，以吞食各種有機物的碎片、藻類、菌類等為生。土壤中的微生物是土壤的組成成分，通過它們的代謝活動，轉(zhuǎn)化土壤中各種物質(zhì)的狀態(tài)，改變土壤的理化性質(zhì)，是構(gòu)成土壤肥力的重要因素。微生物在土壤中的分布狀況（1）水平分布土壤中微生物的水平分布取決于碳源，例如油田地區(qū)存在分解石油的微生物；林區(qū)存在大量分解纖維素的微生物；在動植物殘體較多的土壤中則有較多的氨化細菌和硝化細菌。2）垂直分布土壤中微生物的垂直分布與紫外線的照射、營養(yǎng)、水、溫度、通氣等環(huán)境因子有關(guān)。表層土因受紫外線照射和缺乏水，微生物不易生存，在5~20cm的土層中處微生物數(shù)最多，隨土層的加深，菌數(shù)減少，這是由于缺乏營養(yǎng)和氧氣造成的。1.1.3土壤微生物的分離和計數(shù)多采用稀釋平皿法，操作步驟如下：1.1.3.1取樣選定取樣區(qū)域，去表層土，按對角交叉取樣法取五點土樣混勻。稱取10g混勻土樣兩份，一份用于制備土壤稀釋液，另一份土樣烘干至恒重(105°C,8h)，置于干燥器中冷卻后稱重。1.1.3.2制備土壤稀釋液在含90mL無菌稀釋水和玻璃珠的錐形瓶中加入土樣10g，振蕩10min,制成土壤懸浮液，將土壤懸浮液作10倍遞減稀釋至適當濃度。細菌采用10~10、放線菌采用10~10、霉菌采用10~10為適宜濃度。1.1.3.3混菌法接種取適當濃度的稀釋菌懸液1mL加入無菌平皿，然后倒入合適的培養(yǎng)基趁熱將菌液和培養(yǎng)基混勻。每個稀釋度須做平行。如只進行分離而不計數(shù)，對土壤懸浮液可不作系列稀釋，采用劃線分離法或涂布分離法即可。1.1.3.4培養(yǎng)待培養(yǎng)基冷卻后，倒置于培養(yǎng)箱中，在適宜的溫度下培養(yǎng)相應的時間(細菌在37C下培養(yǎng)Id?2d、放線菌和真菌則在28C下培養(yǎng)5d?7d)。1.1.3.5計數(shù)計數(shù)平皿上出現(xiàn)的菌落。細菌和放線菌選取菌落數(shù)為30?300的平皿真菌選取菌落數(shù)為10?100的平皿進行計數(shù)。如需獲取純種，可取單個菌落進行試管斜面轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)后，選用適宜方法保存。－4－1－3－5－2－41.1.3.6計算每克干土含菌數(shù)每克干土含菌數(shù)=每克濕土含菌數(shù)某濕土重/干土重土壤中微生物的數(shù)量是土壤自凈作用的基礎(chǔ)，也是土壤生物修復的主力軍。由于土壤有團粒結(jié)構(gòu)，又棲息著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物及其他生物，使土壤具有很強的吸附、過濾和生物降解能力。當污水和污物進入土壤后，先被土壤吸附，緊接著又被微生物及其他生物降解，使土壤逐漸恢復到原來的狀態(tài)。水體中的微生物水體可分為天然水體和人工水體。天然水體包括海洋、江河、湖泊等人工水體包括水庫、運河、城市排水系統(tǒng)、各種污水處理系統(tǒng)等。水體中含有微生物所需的各種營養(yǎng)，因而也是微生物的天然生境。水體中微生物除天然棲息者外，還有來自土壤、空氣、動植物殘體、動物排泄物、各類工業(yè)廢水和生活污水中的微生物，其中包括某些病原微生物。1.2.1水中微生物的種類、分布1.2.1.1微生物的種類（1）清水型水生微生物在潔凈的水域中，因營養(yǎng)物較少，微生物數(shù)量也較少。在每毫升水中一般只含幾十個到幾百個細菌，并以自養(yǎng)型種類為主。常見的細菌有綠硫細菌、紫色細菌、藍細菌、柄細菌、赫色纖毛菌、球衣細菌和螢光假單胞菌等。此外，還有許多藻類（如絲狀綠藻、硅藻等）、真菌（水霉菌屬和綿霉菌屬）、原生動物（如鐘蟲及其他固著型纖毛蟲等）和后生動物（如枝角類、橈足類等）。（2）腐敗型水生微生物在受到有機物嚴重污染的水域中，數(shù)量較多的是細菌，每毫升水中可達幾千萬個甚至幾億個，以異養(yǎng)菌為優(yōu)勢。異養(yǎng)菌分解有機物，起重要的凈化作用。常見的微生物中，細菌以變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、產(chǎn)氣堿桿菌等革蘭氏陰性無芽孢菌為主，此外還有芽孢桿菌、生孢梭菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、弧菌、螺菌、假單胞菌，有的甚至還含有傷寒、痢疾、霍亂等病原體；藻類有綠藻、裸藻等；原生動物有草履蟲、屋滴蟲、小口鐘蟲等微生物的分布影響微生物在水體中分布的因素有：水體類型、污染程度、有機物的含量、溶解氧量、水溫、pH及水深等。微生物在水體中的水平分布規(guī)律為：近岸水域中細菌數(shù)量較多，離岸越遠的地方，微生物越少；底泥中的細菌多于水中的細菌。微生物在較深較大的靜水水域中的垂直分布規(guī)律是：在上層水體中（水面下0~10m深處），氧含量較高，主要有好氧細菌（如假單脆菌、柄桿菌、球衣細菌等）、真菌和藻類；中層水體（水深20~30m）主要有光合細菌（如紅硫細菌和綠硫細菌）以及厭氧細菌；底層水體中（30m以下及湖底泥），主要有脫硫弧菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷球菌屬等厭氧細菌。微生物的數(shù)量以5~10m深處為最多，隨著深度的增加而減少。地下水由于經(jīng)過土壤過濾、有機物缺乏，故含菌量遠遠少于地面水，在深層地下水中甚至沒有細菌。1.2.2水的細菌學檢測1.2.2.1細菌總數(shù)（CFU）的測定細菌總數(shù)是將定量水樣（原水樣或作一定稀釋后水樣ImL）接種在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，計數(shù)其上長出的細菌菌落數(shù)，然后換算求出原水樣每mL中所含的細菌數(shù)。其測定步驟和土壤中微生物的分離計數(shù)方法基本相同，但須注意：①水樣是用無菌采樣瓶直接采取水樣；②水樣接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在37C下培養(yǎng)24h；在37C營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中能生長的細菌，代表在人體溫度下能繁殖的異養(yǎng)型細菌。細菌總數(shù)越多，說明水被有機物或糞便污染越重，被病原菌污染的可能性也越大。在生活飲用水中所測得的細菌總數(shù)，除說明水被生活廢棄物污染的程度外，還可指示該水能否飲用?？稍谏铒嬘盟M行衛(wèi)生學評價時提供依據(jù)。我國生活飲用水標準（GB5749-85）規(guī)定，細菌總數(shù)不得超過100個/ml。一般認為在天然水體中，如10?100個/mL，為極清潔的水；100?1000個/mL，為清潔的水；1000?10000個/mL,為不太清潔的水；10000?100000個/mL，為不清潔的水；大于100000個/mL，為極不清潔的水。大腸菌群的測定天然水體的細菌性污染主要源于生活污水中的糞便，即水中的病原菌很可能是腸道傳染病的病原。通常情況下，水中病原菌的含量極少，而細菌種類卻很多，需要耗費大量的人力、物力及復雜的分離培養(yǎng)技術(shù)，才能將病原菌一一檢測出來。最常見的數(shù)量極大的大腸菌群與病原菌同樣來自于動物糞便，根據(jù)這一點，只要通過檢查水樣中的指示菌一一大腸菌群，即可知道該水體被糞便污染的程度，從而間接推測其他病原菌存在的概率。大腸菌群是指那些能在37°C下，24~48h之內(nèi)使乳糖發(fā)酵并產(chǎn)酸產(chǎn)氣、好氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要包括大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣桿菌、枸櫞酸鹽桿菌、副大腸桿菌。大腸埃希氏菌即大腸桿菌是人和溫血動物腸道中的正常細菌，兼性好氧的革蘭氏陰性、無芽抱、兩頭鈍圓的