龍血復(fù)合物對(duì)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的抗衰老作用,細(xì)胞生物學(xué)論文

龍血復(fù)合物對(duì)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的抗衰老作用,細(xì)胞生物學(xué)論文摘要：通過(guò)重建老化皮膚細(xì)胞的體外評(píng)估模型，評(píng)估龍血復(fù)合物〔一種由4種活性成分復(fù)合而成的活性物〕對(duì)正常人皮膚成纖維細(xì)胞和表皮角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞ATP含量和線粒體完好性〔包括：線粒體形態(tài)、線粒體網(wǎng)絡(luò)和線粒體融合蛋白-1的表示出〕的影響。ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定成纖維細(xì)胞和角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)ATP含量，熒光探針染色結(jié)合顯微鏡圖像半定量方式方法評(píng)估線粒體形態(tài)和線粒體網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造的豐度，免疫細(xì)胞熒光染色方式方法分析線粒體融合蛋白-1(Mfn1)的表示出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，龍血復(fù)合物顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞ATP含量，顯著促進(jìn)角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成，龍血復(fù)合物處理的成纖維細(xì)胞線粒體形態(tài)完好、碎片較少、具有愈加豐富的分支構(gòu)造，Mfn1的表示出水平更高層次。研究發(fā)現(xiàn)龍血復(fù)合物通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞ATP產(chǎn)生、保持線粒體完好性、增加線粒體網(wǎng)絡(luò)數(shù)、促進(jìn)Mfn1的表示出，顯示出對(duì)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞的抗衰老作用。本研究中使用的評(píng)估方式方法可以用于挑選針對(duì)與線粒體衰老和生物能量相關(guān)功能的活性成分。本文關(guān)鍵詞語(yǔ):皮膚衰老;龍血復(fù)合物;線粒體;線粒體網(wǎng)絡(luò);線粒體融合蛋白-1;Abstract：Inthisstudy,normalhumanskincellsextractedfromanageddonorwereusedtoestablishtheinvitrosenescentskincellmodel.ThebioenergeticseffectwasevaluatedbymeasuringcellularATPcontentusingCellTiter-Glo?Reagent.Microscopicinspectionandthesemi-quantitativeanalysismethodsofmitochondrialnetworkshavebeenusedtoevaluatethemitochondriaassembledintoflexiblenetworksinmetabolicallyactivecells.Inthemeantime,immuno-cytochemistrystainingwasusedtofutherunderstandthemechanismofmitochondrianetworkformation,andtheexpressionofMitofusin-1wasinvestigated.Withthismodel,theefficacyofDragonsBloodComplex(DBC),abotanicalcomplexcomposedoffouractiveingredients,wasevaluatedwithnormalhumandermalfibroblastsandepidermalkeratinocytesaboutitsbiofunctionsonATPproductionandmitochondrialintegrityincludingmorphologyofmitochondria,aboundanceofmitochondrialnetworks,andtheexpressionofMitofusin-1.TheresultsshowthattheATPlevelinsenescentfibroblastsandkeratinocytesissignificantlyincreasedbyDragonsBloodComplex.TherelativeATPcontentoffibroblastsis117.7%±4.3%comparedwiththecontrolgroup(P0.01)whentreatedwith0.25%DBC.Whentreatedwith0.5%,0.25%,and0.1%DBC,therelativeATPcontentofkeratinocytes,comparedwiththecontrolgroup,are149.8%±9.0%,147.5%±6.4%,and134.0%±8.3%,respectively(P0.001).Byincubationwith0.25%DBC,thecountofmitochondrialnetworkinsenescentkeratinocytesissignificantlypromoted(P0.05).AndintheDBC-treatedfibroblasts,themitochondrianetworksarelessfragmentedandmoreextensivelybranchedinmorphology.Besides,Mitofusin-1ismorewidelyandabundantlyexpressedintheDBC-treatedfibroblasts.ThismightpartlyexplainthepromotioneffectofDBConmitochondrianetworks.Insummary,DBCshowsanti-agingeffectsonfibroblastsandkeratinocytesbypromotingthecellularATPandmitochondria.Theevaluationmethodusedinthisstudycanalsobeappliedtothescreeningofmoreactiveingredientstargetingthefunctionsrelevantwithmitochondrialagingandbioenergetics.Keyword：skinaging;DragonsBloodComplex;mitochondrion;mitochondrialnetwork;Mitofusin-1;皮膚作為人體最大的外層器官，是衰老最明顯的表現(xiàn)。皮膚衰老具體表現(xiàn)出了皮膚完好性和功能性的下降。與衰老相關(guān)的生物學(xué)經(jīng)過(guò)中，線粒體能量產(chǎn)率下降、ROS產(chǎn)量上升，線粒體自噬水平下降，其功能異常成為加速細(xì)胞衰老的關(guān)鍵因素[1,2,3]。眾所周知，生物體保持健康內(nèi)穩(wěn)態(tài)離不開細(xì)胞的正常代謝運(yùn)作，細(xì)胞代謝本質(zhì)上就是活細(xì)胞內(nèi)千萬(wàn)種放能反響和吸能反響的總和，而放能反響和吸能反響之間能量傳遞的紐帶就是ATP分子，線粒體是細(xì)胞的“能量工廠〞，是細(xì)胞ATP的主要制造場(chǎng)所，以ATP的形式為內(nèi)源性反響提供化學(xué)能。另外，線粒體還介入多種細(xì)胞活動(dòng)，如增殖、分化、氧化、衰老和凋亡。線粒體形態(tài)的變化與其功能密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞命運(yùn)和組織構(gòu)成至關(guān)重要。在過(guò)去的十年中，研究探尋求索了線粒體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)線粒體融合和裂變是一直動(dòng)態(tài)存在的，當(dāng)細(xì)胞處于較優(yōu)生長(zhǎng)條件下時(shí)，線粒體的融合率超過(guò)裂變率[4,5]，在這種情況下，線粒體能夠在代謝活潑踴躍的細(xì)胞中聚集成管網(wǎng)狀構(gòu)造。線粒體的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造與ATP產(chǎn)生增加、活性氧產(chǎn)生減少相關(guān)聯(lián)，而碎片形態(tài)與ATP產(chǎn)生減少和線粒體解偶聯(lián)相關(guān)。已經(jīng)報(bào)道了線粒體網(wǎng)絡(luò)的顯微鏡觀察法和半定量分析法[4,6]。當(dāng)前，越來(lái)越多的證據(jù)表示清楚線粒體穩(wěn)態(tài)與皮膚衰老之間存在相關(guān)性，為開發(fā)新的皮膚抗衰老藥物和成分提供了支持。本研究目的是使用老化皮膚細(xì)胞的體外評(píng)估模型，通過(guò)細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等手段定量研究由4種活性成分〔麒麟竭〔Daemonoropsdraco〕、血滿草〔Sambucusadnata〕、鷹嘴豆〔Cicerarietinum〕、喜馬拉雅冰川水〕組成的植物復(fù)合物——龍血復(fù)合物〔DBC〕對(duì)正常人體皮膚細(xì)胞ATP水平變化的深層機(jī)理、ATP生產(chǎn)工廠——線粒體的功能、線粒體狀態(tài)對(duì)皮膚細(xì)胞的影響，以及細(xì)胞呼吸經(jīng)過(guò)中其他一些高能化合物對(duì)皮膚內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響。1、實(shí)驗(yàn)部分1.1、主要試劑與儀器龍血復(fù)合物，麒麟竭提取物、血滿草提取物、鷹嘴豆種子提取物與喜馬拉雅冰川水根據(jù)一定的比例組合配制而成；人皮膚成纖維細(xì)胞〔FB〕、人皮膚角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞〔KC〕，從人皮膚包皮組織〔47歲〕中提??；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基、BovinePituitaryExtract(BPE〕、0.05%Trypsin-EDTA、F-12培養(yǎng)基、DPBS、ATP試劑盒，美國(guó)賽默飛世爾公司；二甲基亞砜〔DMSO〕，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。無(wú)菌操作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)賽默飛世爾公司；VICTORTMX4酶標(biāo)儀，美國(guó)珀金埃爾默公司；EON型微孔分光光度計(jì)，美國(guó)伯騰儀器有限公司；LeicaSP8激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)萊卡公司；ZeissScopeA1顯微鏡，卡爾·蔡司股份公司。1.2、實(shí)驗(yàn)方式方法1.2.1、龍血復(fù)合物對(duì)人體皮膚細(xì)胞毒性的測(cè)定使用來(lái)自老化供體的人皮膚成纖維細(xì)胞〔FB〕和人皮膚角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞〔KC〕，建立衰老細(xì)胞的體外評(píng)估模型。細(xì)胞以5000cells/孔接種于96孔板，每孔100μL，貼壁后，換成0.5%龍血復(fù)合物培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組〔只添加培養(yǎng)基〕。培養(yǎng)48h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，每孔參加200μL0.5mg/mLMTT溶液，培養(yǎng)3h，小心吸除上清液，每孔參加100μLDMSO，設(shè)置調(diào)零組〔只加DMSO〕，輕輕晃動(dòng)叩擊96孔板，待完全融解后，用酶標(biāo)儀在550nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。1.2.2、龍血復(fù)合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP的影響基于細(xì)胞ATP的檢測(cè)是評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)的一種較為靈敏的方式方法[7,8,9]。細(xì)胞以5000cells/孔接種于96孔板，每孔200μL，培養(yǎng)48h后換饑餓培養(yǎng)基，18h后換成0.5%龍血復(fù)合物培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組〔只添加培養(yǎng)基〕，培養(yǎng)48h后使用CellTiter-Glo?試劑測(cè)量細(xì)胞ATP含量。吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清，參加100μL培養(yǎng)基，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔，然后參加100μLCellTiter-GloReagent，輕晃孔板2min混勻，誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，室溫避光反響10min，酶標(biāo)儀讀數(shù)〔Luminescence〕。結(jié)合ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線處理測(cè)試數(shù)據(jù)。1.2.3、線粒體形態(tài)、網(wǎng)絡(luò)定量和線粒體融合蛋白-1(Mfn1〕的分析為了揭示龍血復(fù)合物對(duì)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞ATP促進(jìn)的作用機(jī)制，研究了線粒體的形態(tài)和功能，管網(wǎng)狀的線粒體網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成對(duì)于線粒體呼吸、維持其完好性至關(guān)重要。應(yīng)用細(xì)胞浸透性MitoTracker?RedCMXRos探針標(biāo)記活體成纖維細(xì)胞和角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞中的活性線粒體。染色后，LeicaSP8共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的線粒體形態(tài)，捕獲線粒體的熒光顯微鏡圖像。圖像中線粒體網(wǎng)絡(luò)的半自動(dòng)分析方式方法如Valente等[6]所述，將ImageJ軟件和線粒體網(wǎng)絡(luò)分析工具〔MiNA〕結(jié)合使用。如此圖1所示，原始圖像〔圖1A〕首先通過(guò)閾值處理轉(zhuǎn)換為二值圖像〔圖1B〕，然后利用“Skeletonize〞將二值圖像轉(zhuǎn)換為原始圖像的骨架化圖像〔圖1C〕，進(jìn)而提取細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)的骨架。對(duì)骨架進(jìn)行量化以評(píng)估網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造的豐富程度，每個(gè)圖像中線粒體網(wǎng)絡(luò)的數(shù)量用細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化。通過(guò)這種方式評(píng)估龍血復(fù)合物對(duì)細(xì)胞線粒體完好性的影響。圖1線粒體網(wǎng)絡(luò)Image?J+MiNA分析〔40X),A.?原始圖像；B.?二值圖像；C.?骨架化圖像Fig.1PrincipleofmitochondrialnetworkanalysisbyImageJ+MiNA(Magnification40X),A.Rawimage;B.Binnaryimage;C.Skeletonizedimage細(xì)胞內(nèi)的線粒體是以連通的網(wǎng)絡(luò)形式存在的，為了進(jìn)一步了解線粒體網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的機(jī)制，研究了線粒體融合蛋白-1(Mitofusin-1，簡(jiǎn)稱Mfn1〕的表示出，這種蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)線粒體融合和形態(tài)的關(guān)鍵分子之一[10]。與它的同源物Mitofusin-2(Mfn2〕僅調(diào)節(jié)或介導(dǎo)特定細(xì)胞類型的線粒體融合的特殊形式不同，Mfn1在人體各種類型的細(xì)胞內(nèi)廣泛地表示出[11]。Mfn1在培養(yǎng)細(xì)胞中的強(qiáng)迫表示出導(dǎo)致線粒體特征性網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造的構(gòu)成[12]。Mfn1定位在線粒體的外膜上，研究表示清楚，敲除Mfn1基因時(shí)，線粒體因不能融合而呈現(xiàn)高度碎片化。將培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞用2%多聚甲醛固定，與抗Mfn1一抗孵育，隨后二抗AlexaFluor?488山羊抗小鼠IgG孵育，DAPI復(fù)染，檢測(cè)Mfn1的表示出。ZeissScopeA1顯微鏡拍攝免疫細(xì)胞熒光染色圖像，比擬處理組和未處理組細(xì)胞之間Mfn1的差異表示出。1.3、數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)通過(guò)t檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，“*〞表示與對(duì)照組相比P0.05，“**〞表示與對(duì)照組相比P0.01，“***〞表示與對(duì)照組相比P0.001。2、結(jié)果與討論2.1、龍血復(fù)合物對(duì)人皮膚細(xì)胞的毒性圖2A顯示了對(duì)照組和龍血復(fù)合物處理成纖維細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力，圖2B顯示了對(duì)照組和龍血復(fù)合物處理角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力。結(jié)果表示清楚，用0.5%龍血復(fù)合物處理48h后，與未處理的對(duì)照組相比，皮膚細(xì)胞顯示出稍微但不顯著增加的細(xì)胞活力。MTT測(cè)定結(jié)果表示清楚0.5%的龍血復(fù)合物對(duì)角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性作用。圖2A.龍血復(fù)合物對(duì)老化成纖維細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力；B.?龍血復(fù)合物對(duì)老化角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力Fig.2A.RelativecellviabilityofNTandDBC-treatedsenescentfibroblasts;B.RelativecellviabilityofNTandDBC-treatedsenescentkeratinocytes2.2、龍血復(fù)合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP的影響圖3A顯示了對(duì)照組和龍血復(fù)合物處理組成纖維細(xì)胞ATP的相對(duì)含量，圖3B顯示對(duì)照組和龍血復(fù)合物處理組角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞ATP的相對(duì)含量。結(jié)果表示清楚，當(dāng)用0.25%龍血復(fù)合物處理時(shí)，成纖維細(xì)胞ATP含量比對(duì)照組顯著升高了17.7%(P0.01〕。0.10%～0.50%龍血復(fù)合物顯著提高角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞中ATP含量〔P0.001〕。圖3A.龍血復(fù)合物對(duì)老化成纖維細(xì)胞的相對(duì)ATP含量；B.?龍血復(fù)合物對(duì)老化角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞的相對(duì)ATP含量Fig.3A.RelativeATPcontentofNTandDBC-treatedsenescentfibroblasts;B.RelativeATPcontentofNTandDBC-treatedsenescnetkeratinocytes2.3、龍血復(fù)合物對(duì)線粒體形態(tài)、網(wǎng)狀構(gòu)造和Mfn1的結(jié)果分析從圖4中能夠看到，0.25%龍血復(fù)合物顯著促進(jìn)角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞中線粒體網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成〔P0.05〕，與龍血復(fù)合物處理的細(xì)胞中線粒體網(wǎng)絡(luò)分支增加結(jié)果一致。未經(jīng)處理的角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞中，線粒體豐度減少碎片較多。龍血復(fù)合物處理的成纖維細(xì)胞中，線粒體網(wǎng)絡(luò)在形態(tài)上碎片較少，豐富的分支構(gòu)造，線粒體網(wǎng)絡(luò)的總計(jì)數(shù)與未處理的成纖維細(xì)胞中的總計(jì)數(shù)沒(méi)有顯著差異。如此圖5所示，在未處理的細(xì)胞中，Mfn1表示出微弱，在細(xì)胞質(zhì)中零星分布，而在龍血復(fù)合物處理的細(xì)胞中，Mfn1更廣泛和豐富地表示出。這可能解釋了龍血復(fù)合物對(duì)線粒體網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造的促進(jìn)作用。圖4MitoTracker??Red?CMXRos染色，A.未處理組角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞〔40X);B.?0.25%龍血復(fù)合物處理角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞〔40X);C.龍血復(fù)合物對(duì)角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)數(shù)的影響；D.未處理組成纖維細(xì)胞〔40X);E.?0.25%龍血復(fù)合物處理成纖維細(xì)胞；F.龍血復(fù)合物對(duì)成纖維細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)數(shù)的影響Fig.4MitoTracker?RedCMXRosstaining,A.onnon-treatedkeratinocytes(Magnification40X);B.on0.25%DBC-treatedkeratinocytes(Magnification40X);C.comparisonofmitochondrialnetworkcountbetweenNTandDBC-treatedkeratinocytes(n=3);D.onnon-treatedfibroblasts(Magnification40X);E.on0.25%DBC-treatedfibroblasts(Magnification40X);F.comparisonofmitochondrialnetworkcountbetweenNTandDBC-treatedfibroblasts圖5線粒體融合蛋白-1免疫熒光染色〔綠色：線粒體融合蛋白-1；藍(lán)色：細(xì)胞核〕，A.未處理組成纖維細(xì)胞〔10X);B.龍血復(fù)合物處理組成纖維細(xì)胞〔10X);C.未處理組成纖維細(xì)胞〔25X);D.龍血復(fù)合物處理組成纖維細(xì)胞〔25X)Fig.5ImmunocytochemistrystainingtargetingMitofusin-1(Green:Mitofusin-1;Blue:DAPI),A.onnon-treatedfibroblasts(10X);B.onDBC-treatedfibroblasts(10X);C.onnon-treatedfibroblasts(25X);D.onDBC-treatedfibroblasts(25X)3、結(jié)論使用從老化供體中提取的正常皮膚細(xì)胞建立了體外衰老皮膚細(xì)胞模型。利用該模型從細(xì)胞中的能量通貨ATP和能量工廠線粒體出發(fā)，運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫細(xì)胞染色、超微影像技術(shù)評(píng)估了龍血復(fù)合物對(duì)皮膚細(xì)胞狀態(tài)與細(xì)胞能量、線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示龍血復(fù)合物通過(guò)促進(jìn)皮膚細(xì)胞ATP含量、保持線粒體完好性，增加線粒體網(wǎng)絡(luò)數(shù)、Mfn1更豐富的表示出，提示龍血復(fù)合物可能通過(guò)對(duì)皮膚細(xì)胞ATP水平變化、線粒體功能有益，起到一定的抗衰老作用，有望成為延緩皮膚衰老、維持皮膚內(nèi)穩(wěn)態(tài)的化裝品活性物質(zhì)的使用。本研究中使用的評(píng)估方式方法可以用于挑選與線粒體衰老和生物能量相關(guān)的功能活性成分。以下為參考文獻(xiàn)[1]Lopez-OtinCBlascoMA,PartridgeL,etal.Thehallmarksofaging[J]Cell,2020,153(6)-1194-1217.[2]ChistiakovDA,SobeninIA,RevinVV,etal.Mitochondrialagingandage-relateddysfunctionofmitochondria[J].BioMed.Res.Int.,2020.[3]ParadiesG,ParadiesV,RuggieroFM,etal.Mitochondrialbioenergeticsdecayinaging:beneficialeffectofmelatonin[J].CellMol.LifeSci.,2021,74(21):3897-3911.[4]VowinckelJ,HartJ,ButlerR,etal.MitoLoc:Amethodforthesimultaneousquantificationofmitochondrialnetworkmorphologyandmembranepotentialinsinglecells[J]JMitochondrion,2021,24:77-86.[5]MellemD,SattlerM,Pagel-WolffS,etal.Fragmentationofthemitochondrialnetworkinskininvivo[J].PLoSOne,2021,12(6):174469.[6]ValenteAJ,MaddalenaLA,RobbEL,etal.AsimpleImageJmacrotoolforanalyzingmitochondrialnetworkmorphologyinmammaliancellculture[J]Acta.Histochem.,2021,119(3):315-326.[7]PettyRD,SutherlandLA,HunterEM,etal.AComparisonofMTTandATP