山東大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)方法

光學(xué)顯微鏡（lightmicroscope）電子顯微鏡（electronmicroscope）掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope）第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法當(dāng)前1頁，總共111頁。尼康E-600顯微鏡

一、光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡普通顯微鏡由聚光器、物鏡和目鏡三部分組成。當(dāng)前2頁，總共111頁。小鼠肝細(xì)胞中糖原人肝癌細(xì)胞中的微絲蛋白當(dāng)前3頁，總共111頁。LightPathwayofMicroscope當(dāng)前4頁，總共111頁。普通顯微鏡最大放大倍數(shù)1000－1500倍因?yàn)樗姆直媛视邢蓿俜糯笠彩强辗糯螽?dāng)前5頁，總共111頁。

分辨率（resolution）：能將物體相近兩點(diǎn)分辨清楚的距離極限

D代表分辨力：D=0.61/N.A.代表光波波長；N.A.為鏡口率，也稱數(shù)值孔徑（Numericalaperture)。

N.A.=nSin/2

n：物鏡與標(biāo)本間介質(zhì)的折射率；（1或1.515）

：鏡口角（聚光焦點(diǎn)對物鏡鏡口的張角，<180o）物鏡鏡口標(biāo)本結(jié)論：通過公式可知光學(xué)顯微鏡最大分辨率0.2um減小分辨率需減小

當(dāng)前6頁，總共111頁。介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66顯微鏡的幾個光學(xué)特點(diǎn)：介質(zhì)折射率越接近鏡頭玻璃的（1.7）越好。sinα/2的最大值小于1；普通光線的波長為400~700nm，光鏡分辨力約為0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。當(dāng)前7頁，總共111頁。（二）紫外線顯微鏡（ultravioletmicroscope）根據(jù)光學(xué)原理，光源光波越短，顯微鏡的分辨本領(lǐng)越大。紫外線顯微鏡以紫外線為光源，分辨率可提高一倍。可看到在普通光學(xué)顯微鏡下看不到的膠體顆粒?？捎脕頊y定細(xì)胞中的核酸含量。透鏡：石英、螢石（CaF2)、碳酸鋰等制作。價格昂貴，使用受限。當(dāng)前8頁，總共111頁。（三）熒光顯微鏡（fluorescentmicroscope）20世紀(jì)40年代在紫外線顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)明。原理：細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射也可發(fā)熒光。熒光顯微鏡對這類物質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究。當(dāng)前9頁，總共111頁。結(jié)構(gòu)：在普通光學(xué)顯微鏡上添加一些附件：A.光源：通常采用超高壓汞燈或氙燈，由它發(fā)出各種波長的光。B.濾片：根據(jù)性能分為兩組。一組是激發(fā)濾片，作用是僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其它光都吸收掉。二是阻斷濾片，安裝在物鏡后，作用是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡，以免干擾熒光和刺傷眼睛；選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分等的研究。當(dāng)前10頁，總共111頁。熒光顯微鏡熒光顯微照片(微管綠,微絲紅,核藍(lán))當(dāng)前11頁，總共111頁。（四）暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）原理：顯微鏡加裝特殊裝置，使直射光不能進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射、衍射的光線進(jìn)入物鏡特點(diǎn)：視野的背景是暗的，樣品是的邊緣是亮的。特殊裝置：在聚光器中加裝中央遮光板或者使用暗視野光闌當(dāng)前12頁，總共111頁。暗視野照明方式

當(dāng)前13頁，總共111頁。能見到小至5nm的質(zhì)點(diǎn)，分辨率比普通顯微鏡高40倍。有些細(xì)胞器如核、線粒體亦可見。能夠看到正在運(yùn)動的微小物體（如精子），也能看到不運(yùn)動的及某些不能被染色的脂粒，因而常用于微生物與膠體化學(xué)研究。當(dāng)前14頁，總共111頁。（五）相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）相差顯微鏡由P．Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。原理：將透過標(biāo)本的可見光的光程差（也就是相位差）變成光強(qiáng)差（即振幅差），從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。

當(dāng)前15頁，總共111頁。相差顯微鏡體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞當(dāng)前16頁，總共111頁。構(gòu)造：聚光器或光源上安裝環(huán)狀光闌（annulardiaphragm)；在物鏡中加了環(huán)形相板(annularphaseplate)。當(dāng)前17頁，總共111頁。光闌的作用：使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標(biāo)本上。光線透過標(biāo)本發(fā)生衍射，偏離了未透過標(biāo)本的光線線路，波長延遲1/4。相板作用：相板上有一環(huán)形區(qū)制成凹槽或凸起，器深度可使通過此區(qū)的光線提前或延遲1/4。主要用于觀察活細(xì)胞或活組織，是體外細(xì)胞和組織培養(yǎng)工作的重要工具。當(dāng)前18頁，總共111頁。當(dāng)前19頁，總共111頁。（六）微分干涉差顯微鏡（differentialinterferencecontrast(DIC)microscope

）1952年，Normaski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明。能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。

DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）

當(dāng)前20頁，總共111頁。

分離的有絲分裂紡錘體左、微分干涉顯微鏡；中、相差顯微鏡；右、偏振光顯微鏡。當(dāng)前21頁，總共111頁。（七）激光共聚焦掃描顯微鏡（laserconfocalscanningmicroscope）

用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像。由于激光束的波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的定量。

當(dāng)前22頁，總共111頁。laserconfocalscanningmicroscope,LCSM當(dāng)前23頁，總共111頁。LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)當(dāng)前24頁，總共111頁。當(dāng)前25頁，總共111頁。光學(xué)顯微鏡小結(jié)普通光學(xué)顯微鏡：0.2um紫外線顯微鏡：0.1um熒光顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡微分干涉差顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡當(dāng)前26頁，總共111頁。二、電子顯微鏡（electronmicroscope）簡稱電鏡電子顯微鏡以電子束代替了可見光，大大提高了顯微鏡的分辨率，可以觀察細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)。電子束的波長與電壓成反比，波長極短。例如，電壓為6萬伏，則=0.0488埃，比最短的可見光4000埃約小10萬倍。當(dāng)前27頁，總共111頁。德國西門子公司制成了第一臺電子顯微鏡，當(dāng)時分辨率只有3nm。1964年后達(dá)到0.3nm，現(xiàn)在最佳性能的電鏡分辨本領(lǐng)可達(dá)nm。當(dāng)前28頁，總共111頁。電鏡的基本構(gòu)造主要如下：

A：電子束照明系統(tǒng)；

B：電磁透鏡成像系統(tǒng)；

C：真空系統(tǒng)；

D：記錄系統(tǒng)；

E：電源系統(tǒng)。

當(dāng)前29頁，總共111頁。電鏡與光鏡的主要區(qū)別：

光鏡電鏡

光源

可見光電子束

介質(zhì)空氣（香柏油）真空

聚光鏡光學(xué)透鏡電磁透鏡

分辨力

0.30.1um0.1nm

放大倍數(shù)

1000倍百萬倍

當(dāng)前30頁，總共111頁。（一）透射電子顯微鏡（TEM：transmissionelectronmicroscope）觀察標(biāo)本內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)放大近百萬倍超薄切片（500埃）通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差。

當(dāng)前31頁，總共111頁。JEM-1011透射電子顯微鏡當(dāng)前32頁，總共111頁。

正在凋亡的乳腺細(xì)胞核被膜破裂，染色質(zhì)凝集當(dāng)前33頁，總共111頁。細(xì)胞毒T細(xì)胞結(jié)合到靶細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）上當(dāng)前34頁，總共111頁。細(xì)胞毒T細(xì)胞殺死了靶細(xì)胞當(dāng)前35頁，總共111頁。冰凍蝕刻（freeze-etching)，或冰凍斷裂(freeze-fracture)配合透射電鏡觀察而設(shè)計(jì)的一種標(biāo)本制作技術(shù)。研究生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有用技術(shù)。當(dāng)前36頁，總共111頁。當(dāng)前37頁，總共111頁。主要步驟：

A.冰凍標(biāo)本（-1000C干冰或-1960C液氮）

B.冷刀斷開標(biāo)本（冰凍斷裂）

C.升溫，冰升華，斷裂面結(jié)構(gòu)暴露（蝕刻）

D.表面噴一層蒸汽碳和鉑，

E.將組織溶掉，碳和鉑的膜稱復(fù)膜（replica）F.電鏡下觀察復(fù)膜，復(fù)膜構(gòu)造=標(biāo)本構(gòu)造當(dāng)前38頁，總共111頁。當(dāng)前39頁，總共111頁。冰凍蝕刻電鏡照片

當(dāng)前40頁，總共111頁。（二）掃描電子顯微鏡（SEM：scanningelectronmicroscope）觀察標(biāo)本表面形態(tài)結(jié)構(gòu)標(biāo)本特殊處理：固定脫水后，噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。當(dāng)前41頁，總共111頁。

JEOL掃描電子顯微鏡

當(dāng)前42頁，總共111頁。人類血細(xì)胞SEM照片當(dāng)前43頁，總共111頁。

彈性纖維網(wǎng)

左：狗主動脈的低倍掃描電鏡圖片；右：同一血管外層的

縱向排列的致密彈性纖維網(wǎng)（高放大倍數(shù)）。

其它成分已用酶和甲酸消化。當(dāng)前44頁，總共111頁。一個典型的有絲分裂中期的染色體近末端區(qū)域的掃描電鏡照片一個有絲分裂染色體的染色單體的透射電鏡照片當(dāng)前45頁，總共111頁。一個正在分裂的動物培養(yǎng)細(xì)胞，掃描電鏡圖片當(dāng)前46頁，總共111頁。早期小鼠胚胎的掃描電鏡照片A：2細(xì)胞時期B：4細(xì)胞時期C：8-16細(xì)胞時期，桑椹胚D：胚泡期ABCD當(dāng)前47頁，總共111頁。三、掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope,STM)Binning,Rohrer等1981年發(fā)明，獲1986年諾貝爾獎。用來顯示晶體表面原子布陣的一種顯微鏡。原理：加上一定電壓的精密探針。鎢絲或白金絲，直徑幾個埃。電子在樣品與探針之間（距離幾個埃）轉(zhuǎn)移形成電流。特點(diǎn)：nm，縱向?yàn)?.001nm.三維圖像。三態(tài)物質(zhì)均可觀察。當(dāng)前48頁，總共111頁。細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)顯微光譜分析技術(shù)放射自顯影術(shù)超離心技術(shù)分子雜交技術(shù)PCR技術(shù)第二節(jié)生物化學(xué)分析當(dāng)前49頁，總共111頁。一、細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)技術(shù)細(xì)胞化學(xué)染色是利用染色劑可同細(xì)胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理，從而對某種成分進(jìn)行研究和分析。細(xì)胞的各種成分幾乎都能顯示，包括有無機(jī)物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。當(dāng)前50頁，總共111頁。例：DNA的Feulgen反應(yīng)顯示法1924年，F(xiàn)eulgen和Rossenbeck發(fā)明。原理：鹽酸水解，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，出現(xiàn)醛基，試劑中的無色品紅與醛基反應(yīng)，呈現(xiàn)紫紅色。例：

PAS（高碘酸席夫反應(yīng)）──鑒定多糖類物質(zhì)醛基與Schiff試劑反應(yīng)，生成紅色化合物。當(dāng)前51頁，總共111頁。二、免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry)是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特異抗原專一結(jié)合，對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)?？乖饕獮榇蠓肿踊蚺c大分子結(jié)合的小分子；抗體則是由漿細(xì)胞針對特異的抗原分泌的r球蛋白。如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。

當(dāng)前52頁，總共111頁。方法：原位分析體外蛋白質(zhì)分析（一）原位分析★免疫反應(yīng)

直接法：Ag+Ab*鏡檢（*代表標(biāo)記物）間接法：Ag+Ab1+Ab2*鏡檢當(dāng)前53頁，總共111頁。標(biāo)記物可以為多種：熒光素─免疫熒光技術(shù)或稱熒光抗體法酶─酶標(biāo)抗體法放射性同位素標(biāo)記—放射自顯影鐵蛋白標(biāo)記免疫膠體金技術(shù)常用標(biāo)記物：熒光素、酶。常用熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明；常用的酶：辣根過氧化物酶。當(dāng)前54頁，總共111頁。動物細(xì)胞的分裂過程當(dāng)前55頁，總共111頁。當(dāng)前56頁，總共111頁。（二）體外蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)印跡法（Westernblotting）技術(shù)路線：（圖）樣品制備—樣品分離—樣品轉(zhuǎn)移—免疫反應(yīng)——檢測蛋白質(zhì)由SDS聚丙烯凝膠硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移的過程即為印跡（blotting）當(dāng)前57頁，總共111頁。三、顯微光譜分析技術(shù)細(xì)胞中有些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線，如核酸的吸收波長260nm，蛋白質(zhì)280nm。有些成分經(jīng)組織化學(xué)染色后，對可見光有特定的吸收光譜。當(dāng)前58頁，總共111頁。根據(jù)細(xì)胞成分所具有的這種特性，可利用細(xì)胞分光光度計(jì)對一定的成分進(jìn)行定位、定性，甚至定量測定。當(dāng)前59頁，總共111頁。四、流式細(xì)胞術(shù)*儀器：流式細(xì)胞計(jì)—flowcytometer*特點(diǎn)：細(xì)胞是高速運(yùn)動的*主要應(yīng)用：用于定量測定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測定細(xì)胞群體中不同時相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞。當(dāng)前60頁，總共111頁。五、放射自顯影（radioautography)放射自顯影技術(shù)：利用放射性物質(zhì)使照相乳膠膜感光，再經(jīng)顯影以顯示該物質(zhì)自身的存在部位的技術(shù)。由于有機(jī)大分子均含有碳、氫原子，實(shí)驗(yàn)室一般采用14C、3H標(biāo)記。14C、3H均為弱β放射性同位素，半衰期長。當(dāng)前61頁，總共111頁。一般常用3H胸腺嘧啶脫氧核苷來顯示DNA，用3H尿嘧啶核苷顯示RNA。在研究蛋白質(zhì)和粘多糖時，分別選用3H氨基酸、3H甘露糖、3H巖藻糖等。當(dāng)前62頁，總共111頁。3H-尿嘧啶脈沖標(biāo)記的細(xì)胞，示異染色質(zhì)區(qū)（核內(nèi)白色區(qū)）無轉(zhuǎn)錄活性當(dāng)前63頁，總共111頁。五、超離心技術(shù)高速離心：10000—25000r/min超速離心：轉(zhuǎn)速大于25000r/min沉降系數(shù)（“S”—Svedbergunit）:單位離心場中溶質(zhì)分子的沉降速度1S相當(dāng)于110-13s離心目的：分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。當(dāng)前64頁，總共111頁。離心種類：分析離心：用于分析和測定制劑中的大分子的種類和性質(zhì)等制備離心：差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離（介質(zhì)蔗糖、氯化銫）當(dāng)前65頁，總共111頁。當(dāng)前66頁，總共111頁。微粒體(microsomes)在超離心時，分離出的小泡狀成分，系由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜的碎片組成，小泡的外表面常附有核糖體，是研究糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能活動的良好材料。當(dāng)前67頁，總共111頁。當(dāng)前68頁，總共111頁。當(dāng)前69頁，總共111頁。六、分子雜交技術(shù)（molecularhybridization)原理：具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。當(dāng)前70頁，總共111頁。方法：原位雜交體外分析核酸的主要方法★Southernblotting又稱DNA印跡法Northernblotting又稱RNA印跡法當(dāng)前71頁，總共111頁。原位雜交（insituhybridization)：在不破壞細(xì)胞或細(xì)胞器的情況下，用核酸探針檢測特定核苷酸序列在染色體上的精確位置的技術(shù)。染色體在高pH值條件下，DNA解鏈，帶標(biāo)記的核酸探針即刻與染色體一定部位雜交。既可檢測DNA序列，也可檢測RNA序列。帶放射性的DNA探針，放射自顯影；免疫探針法。當(dāng)前72頁，總共111頁。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交

當(dāng)前73頁，總共111頁。

熒光原位雜交顯示的著絲粒衛(wèi)星DNA（黃）當(dāng)前74頁，總共111頁。七、PCR技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理：將DNA片段經(jīng)過若干次解鏈和復(fù)性循環(huán)，大量擴(kuò)增，甚至可擴(kuò)增到十幾億倍，以便于對已知DNA片段進(jìn)行分析，如基因分析、序列分析、進(jìn)化關(guān)系分析和臨床診斷等。一般可擴(kuò)增106-107。DNA聚合酶：Taq酶，來源于一種嗜熱水生菌。最適作用溫度75-80度，95度下短時間不失活。當(dāng)前75頁，總共111頁。第三節(jié)細(xì)胞生理學(xué)技術(shù)1、膜電位檢測技術(shù)細(xì)胞內(nèi)外存在電位差（20~100mV）稱為膜電位，膜電位的變化反應(yīng)了細(xì)胞的生理變化2、膜片鉗位記錄技術(shù)主要用于檢測單個特定離子通道性質(zhì)及變化3、細(xì)胞電泳細(xì)胞表面帶有許多電荷，因而可以在外加電場的作用下移動當(dāng)前76頁，總共111頁。第四節(jié)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下研究單個細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)的功能活動十分困難?；罴?xì)胞離體培養(yǎng)當(dāng)前77頁，總共111頁。（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)20世紀(jì)初，Harrison（1907）兩棲類胚胎神經(jīng)管組織懸浮培養(yǎng)，神經(jīng)細(xì)胞存活多天，觀察到神經(jīng)細(xì)胞分化成神經(jīng)元，伸出了軸突。20世紀(jì)40年代，W.Earle和R.Dulbecco設(shè)計(jì)出細(xì)胞培養(yǎng)液配方，并將組織分散成單個細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)工作廣泛展開。當(dāng)前78頁，總共111頁。當(dāng)前79頁，總共111頁。體外培養(yǎng)細(xì)胞生長特點(diǎn)：接觸抑制現(xiàn)象細(xì)胞消化方法：酶法：胰酶，果膠酶非酶法：EDTA當(dāng)前80頁，總共111頁。細(xì)胞培養(yǎng)方式：A.

群體培養(yǎng)（massculture)：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層。B.

克隆培養(yǎng)(clonalculture)：將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生殖生長，每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，此種集落即稱為克?。╟lone)。當(dāng)前81頁，總共111頁。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

當(dāng)前82頁，總共111頁。C.

轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法：使用大容量的原培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)過程中不斷地轉(zhuǎn)動，使培養(yǎng)細(xì)胞始終處于懸浮狀態(tài)之中而不貼壁，用于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)而制取細(xì)胞產(chǎn)品。當(dāng)前83頁，總共111頁?；瘜W(xué)合成培養(yǎng)基：TC-199，RPMI-1640等細(xì)胞培養(yǎng)中要注意：細(xì)胞所需要的營養(yǎng)成分要盡量滿足要保持適當(dāng)?shù)臐B透壓嚴(yán)格控制pH值添加細(xì)胞所需的生長因子血清？當(dāng)前84頁，總共111頁。正常組織的初級培養(yǎng)物，細(xì)胞傳代培養(yǎng)的壽命有一定的限度只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去轉(zhuǎn)化：正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而成癌性細(xì)胞。當(dāng)前85頁，總共111頁。細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念外植體：用于體外培養(yǎng)的組織和細(xì)胞群原代培養(yǎng)（primaryculture）──原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)（sub-culture）當(dāng)前86頁，總共111頁。細(xì)胞株:通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物稱為細(xì)胞株。

細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即稱為細(xì)胞系（CellLine），因此細(xì)胞系可泛指一般可能傳代的細(xì)胞?？寺。阂粋€細(xì)胞經(jīng)有絲分裂繁殖的一群后代當(dāng)前87頁，總共111頁。（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞—體外不能分化，不能形成組織；植物細(xì)胞—體外可分化發(fā)育為植株，即再生植株。當(dāng)前88頁，總共111頁。植物細(xì)胞培養(yǎng)分為：1.花藥或花粉培養(yǎng)：花粉培養(yǎng)液愈傷組織分化培養(yǎng)基長出莖葉另一分化培養(yǎng)基根形成花盆植株2.胚和胚珠培養(yǎng)：胚幼胚培養(yǎng)基2~3周分化胚狀體的培養(yǎng)基長出莖葉……3.莖頂端培養(yǎng)：莖頂或葉片組織酶消化單細(xì)胞愈傷組織途徑……當(dāng)前89頁，總共111頁。4.原生質(zhì)體高滲培養(yǎng)基生成細(xì)胞壁分化培養(yǎng)基愈傷組織……

植物細(xì)胞經(jīng)纖維素酶或果膠酶去掉細(xì)胞壁即成原生質(zhì)體，原生質(zhì)體可進(jìn)行細(xì)胞融合及轉(zhuǎn)基因操作。當(dāng)前90頁，總共111頁。二、顯微操作技術(shù)在顯微鏡下，用顯微操作裝置對細(xì)胞進(jìn)行解剖手術(shù)和微量注射的技術(shù)。顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。當(dāng)前91頁，總共111頁。

三、細(xì)胞融合概念：真核細(xì)胞通過介導(dǎo)和培養(yǎng)，兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合（cellfusion)或細(xì)胞雜交（cellhybridization)。基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱為同核體（homokaryon)；來自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體（heterokaryon)。當(dāng)前92頁，總共111頁。同種細(xì)胞在培養(yǎng)時2個靠在一起的細(xì)胞自發(fā)合并，稱自發(fā)融合；異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合，稱誘發(fā)融合。誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有三種：生物方法（病毒）、化學(xué)方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電激和激光）。當(dāng)前93頁，總共111頁。細(xì)胞融合不僅可用于基礎(chǔ)研究，而且還有重要的應(yīng)用價值，在植物育種方面已經(jīng)成功的有蘿卜+甘藍(lán)、粉藍(lán)煙草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等。小麥+各種禾本科草單克隆抗體技術(shù)是細(xì)胞雜交技術(shù)的成功應(yīng)用.正常淋巴細(xì)胞（如小鼠脾細(xì)胞）具有分泌抗體的能力，但不能在體外長期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國人Kohler和Milstein1975將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎。當(dāng)前94頁，總共111頁。單克隆抗體技術(shù)當(dāng)前95頁，總共111頁。當(dāng)前96頁，總共111頁。

四、染色體分析技術(shù)（一）核型分析

概念：真核生物中染色體的數(shù)量和形態(tài)具有物種的特異性。將體細(xì)胞核中的全部染色體的顯微圖像按照大小、著絲粒位置，以至帶型有序地排列起來，此圖像排列即稱為核型(karyotype)或染色體組型。當(dāng)前97頁，總共111頁。核型分析以中期染色體為準(zhǔn)。制作過程：首先用秋水仙素抑制紡錘絲的形成，使中期染色體停留在赤道面處；然后用低滲法將細(xì)胞脹破，使細(xì)胞的染色體鋪展到載玻片上；最后將染色體的顯微圖像裁剪排列即成。美籍華人徐道覺首創(chuàng)。當(dāng)前98頁，總共111頁。（二）染色體分帶（chromosomebinding)美籍華人徐道覺首創(chuàng)。利用一定的染色方法可顯示出染色體上有一定排列順序的明暗相間的帶，帶的排列方式稱為帶型（bindpattern)，每一染色體均各具有特定的帶型。根據(jù)帶型可鑒別染色體