微生物鑒定技術(shù)在藥品檢驗及監(jiān)管中的應(yīng)用(簡)徐 偉 東

微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用四微生物污染監(jiān)管方式的思考五背景介紹一當前1頁，總共89頁。一、背景介紹在1993-1998年間，美國FDA報告的由微生物污染引起的召回案件達到1370件，占所有產(chǎn)品召回案件的36%我國藥品微生物污染的調(diào)查數(shù)據(jù)較少，但微生物污染仍居首位，近期披露的黑龍江完達山刺五加注射液受微生物污染的問題，已經(jīng)造成了十分嚴重后果和無法挽回的損失。藥品安全管理仍存在監(jiān)管漏洞，造成定性難、溯源難、應(yīng)變慢等問題，以及新的致病微生物或變異體的出現(xiàn)，導(dǎo)致藥品受到微生物污染我國各大城市不斷承辦國際大型體育賽事和國際會議尤其是2010年在我國召開的上海世界博覽會，也進一步增強了對藥品的監(jiān)督管理水平的要求。當前2頁，總共89頁。對微生物分類水平較低，只能鑒定到“屬”，鑒定微生物種類有限傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限當前3頁，總共89頁。分子方法分子生物學(xué)技術(shù)研究的是微生物DNA序列信息，常用于細菌分類的16SrDNA也有1500個堿基，每個堿基位置由ATGC四種核苷酸中的一種組成，多樣性可達種可能（約）10900。新版的《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》微生物DNA變異信息為主傳統(tǒng)方法人類已知的土壤微生物已達到10萬種現(xiàn)在常用的微生物鑒定用生化反應(yīng)只有20多種，實際經(jīng)過研究形成一致標準的、有意義的生化鑒定結(jié)果僅2000多種。微生物生化鑒定金標準的API鑒定系統(tǒng)——僅能鑒定550種細菌通過碳源利用進行微生物鑒定的Biolog系統(tǒng)也僅能鑒定2000種微生物當前4頁，總共89頁。

微生物變異能力強，生化反應(yīng)準確度不高，錯檢漏檢現(xiàn)象普遍傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限當前5頁，總共89頁。生化反應(yīng)鑒定主要是利用不同微生物自身所特有的不同酶系統(tǒng)，根據(jù)微生物利用分解底物的種類和營養(yǎng)來源進行分類鑒定。在大多數(shù)情況下，同“屬”微生物的酶系統(tǒng)基本相同，可以達到鑒定的目的微生物DNA突變能力強，如果這些突變點涉及到微生物酶系統(tǒng)的表達，就會造成酶活性降低甚至酶缺陷，導(dǎo)致鑒定失敗在現(xiàn)行國家標準中，只有血漿凝固酶陽性反應(yīng)才會被確證為金黃色葡萄球菌陽性，陰性反應(yīng)的微生物則被作為無害菌處理。然而，近幾年引起高度關(guān)注的血漿凝固酶陰性金黃色葡萄球菌的流行使得金黃色葡萄球菌被漏檢，血漿凝固酶陰性金黃色葡萄球菌往往含有腸毒素和其他毒素，是引起醫(yī)院感染、社區(qū)食物中毒的重要污染源。當前6頁，總共89頁。不能對微生物污染進行準確溯源分析傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限當前7頁，總共89頁。在進化過程中生物DNA分子會形成大量DNA多態(tài)性區(qū)域和非編碼DNA序列。不會造成生物種屬歸類爭議也不會造成任何形態(tài)上或酶系統(tǒng)表達的改變通過生化鑒定方法無法對這類變化進行有效的分析DNA位點變化卻包含大量重要的微生物所獨有的進化信息，可以與其他來源的同種微生物相區(qū)別，也是微生物種內(nèi)差異的來源當前8頁，總共89頁。如常用于真菌種類鑒定的ITS基因ITS片段能保持相對穩(wěn)定的變異頻率親緣關(guān)系非常接近的2個種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進化特征當前9頁，總共89頁。微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用四微生物污染監(jiān)管方式的思考五背景介紹一當前10頁，總共89頁。2.1技術(shù)手段2.2方法比較當前11頁，總共89頁。2.1技術(shù)手段2.2方法比較當前12頁，總共89頁。革蘭氏染色鏡鑒按照標準進行傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定API試劑條菌鑒定國際金標準

半自動細菌鑒定儀（ATBExpression）

全自動細菌鑒定儀（VITEK2）微生物鑒定手段MiniVIDAS篩選系統(tǒng)免疫凝集/免疫沉淀實驗微生物檢測手段熒光定量PCR(BAX)色譜、光譜分析技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)傳統(tǒng)篩選方法2.1技術(shù)手段當前13頁，總共89頁。GenBankPCR基因分型分子雜交陽性菌分子水平上的鑒定1234當前14頁，總共89頁。1.形態(tài)學(xué)鑒定3.核糖體水平上的鑒定APIVITEK16SrDNA序列分析分子雜交（DupontRiboPrinter）2.生化鑒定傅里葉紅外光譜Rep-PCR(DiversiLab)4.全基因組水平上的鑒定5.脈沖場電泳技術(shù)(PFGE),多位點序列分析(MLST),多位點重復(fù)串聯(lián)序列分析(MLVA),隨機擴增多態(tài)性分析技術(shù)（RAPD)當前15頁，總共89頁。API試劑條——菌鑒定國際金標準無需專用儀器，標準化手工方法完成細菌的生化鑒定，為低成本替代傳統(tǒng)手工細菌生化鑒定的最佳產(chǎn)品。特點：完整的鑒定譜：15種試條，可鑒定的細菌多于550種簡單方便：標準化方法，成本低廉，判讀結(jié)果簡單快速結(jié)果：4-24小時。當前16頁，總共89頁。半自動細菌鑒定儀（ATBExpression）檢測項目：可鑒定由環(huán)境、原料及制成品分離出的菌種和藥敏試驗（包括：腸桿菌、非發(fā)酵G（-）桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、酵母菌、厭氧菌）?？设b定770種細菌和分析近80種抗生素藥敏實驗。當前17頁，總共89頁。原理：鑒定試條包含風(fēng)干底物的反應(yīng)孔，經(jīng)標準濁度的菌液活化，于指定溫度培養(yǎng)4小時/24小時后即可。計算機根據(jù)閱讀器檢測到的結(jié)果自動調(diào)用相應(yīng)試劑條數(shù)據(jù)庫，得出生化/同化結(jié)果和藥敏試驗結(jié)果。系統(tǒng)將所得編碼跟數(shù)據(jù)庫的典型菌株生化譜比較，以客觀的2個參數(shù)（鑒定百分率及T-值）計算鑒定結(jié)果特點：速度快捷ATBExpression提供自動化接種，閱讀及分析試條結(jié)果。準確可靠的結(jié)果ID32及快速ID32試條由金牌標準API試條改良而成，配合自動化概念，結(jié)合成完整的細菌鑒定系統(tǒng)當前18頁，總共89頁。全自動細菌鑒定儀（VITEK2）檢測項目：根據(jù)需要鑒定的微生物的種類的不同，設(shè)計了不同的鑒定卡片，比如革蘭氏陰性菌卡，革蘭氏陽性菌卡，酵母菌卡等。可鑒定405種細菌，70多種藥物約50多種藥物組合的藥敏卡。當前19頁，總共89頁。原理：儀器的原理其實就是我們進行細菌鑒定中使用的生化反應(yīng)。儀器把30個對細菌鑒定必需的生化反應(yīng)培養(yǎng)基固定到卡片上，然后通過培養(yǎng)后儀器對顯色反應(yīng)進行判斷，利用數(shù)值法進行判定。特點：快速：鑒定結(jié)果平均只需4-6小時。對與快速生長細菌(大腸埃希氏、糞腸球菌、變形桿菌、克雷伯氏菌等)鑒定可提前到2小時。操作簡便：全部操作自動化，簡單而方便資料處理：bioLIAISON軟件集中管理實驗室資料獲得AOAC國際認證：保證提供的微生物鑒定結(jié)果是公認的當前20頁，總共89頁。全自動熒光免疫分析儀(mini-VIDAS)

檢測項目：食品及環(huán)境中最常見致病性細菌（李斯特菌屬、單核增生李斯特菌、彎曲菌屬、大腸桿菌O157、沙門氏菌屬、葡萄球菌腸毒素檢測）的快速篩檢。當前21頁，總共89頁。原理：

以免疫技術(shù)捕獲目標微生物，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法，最后測藍色熒光（ELFA）。包被針上有抗體包被，所測得的熒光與標本中抗原的含量成正比。特點：結(jié)果準確：對每個標本做兩次免疫反應(yīng)，保證結(jié)果的可靠。靈敏度比可見光方法高出1000倍。已獲得美國FDA、日本厚生省、AOAC、USDA、中國進出口商品檢驗局等政府及權(quán)威機構(gòu)認可?？赏瑫r進行12個相同或不同的測試。每天進行約60—80項測試特異性強：標本不需分離出目標微生物即可上機檢測。避免交叉污染：沒有采樣針，避免標本之間交叉污染；樣品不與儀器接觸，儀器內(nèi)沒有抽吸樣品的管路，杜絕了標本對環(huán)境的污染全自動化、操作簡便當前22頁，總共89頁。熒光定量PCR聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（PCR）是分子生物學(xué)技術(shù)最具有代表性的技術(shù)。它是一種能在體外將微量生物DNA分子進行數(shù)百萬倍放大的新型檢測技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，通過熒光染料的結(jié)合，將檢測信號進一步放大，其靈敏度是普通PCR的幾百倍，并且整個擴增和檢測過程由儀器自動完成，檢測同量高，速度快，減少了人為誤差和環(huán)境干擾因素，克服了普通PCR易污染的問題，除去樣品前增菌時間，5小時內(nèi)可得到檢測結(jié)果。微生物檢測限可能達到1CFU/mL以下，而且抗雜菌干擾能力強當前23頁，總共89頁。DNA測序技術(shù)DNA測序技術(shù)可以將生物的遺傳信息完整的破譯出來，通過直接比較不同類群個體同源核酸的核苷酸排列順序，獲得生物進化、變異的詳細信息如細菌的16SrDNA和真菌的ITS序列，已經(jīng)被廣泛測定應(yīng)用于菌種鑒定研究之中。由于DNA測序方法耗時短，準確度高，在細菌、真菌、植物、動物的種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究方面得到了越來越廣泛的應(yīng)用當前24頁，總共89頁。a)微生物污染溯源分析目前微生物分型技術(shù)常用于流行病學(xué)調(diào)查和毒力分析國際上普遍認同脈沖凝膠電泳技術(shù)作為微生物分型的標準方法現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可用來區(qū)別近緣種，并在研究微生物種內(nèi)或種組間不同的污染來源及地理親緣關(guān)系的研究中顯示出廣泛的應(yīng)用前景

b)相似微生物DNA序列比對和微生物進化分析根據(jù)生物DNA序列的特異性分析，可檢測生物基因的微小變化，監(jiān)控和預(yù)測微生物污染的爆發(fā)16SrDNA分型已被廣泛認可，微生物16SrDNA進化樹對目標微生物進行詳細的基因分型，同時還可了解不同來源微生物的進化關(guān)系和親緣關(guān)系。該技術(shù)應(yīng)用范圍寬，發(fā)展前景廣，發(fā)展?jié)摿薮螽斍?5頁，總共89頁。指紋圖譜技術(shù)分子雜交技術(shù)首先用限制性內(nèi)切酶對細菌基因組DNA進行酶消化，通過特異性探針與目標DNA序列的雜交結(jié)合，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜技術(shù)和顯色技術(shù)形成該細菌特有的雜交圖譜。現(xiàn)有成熟的基于16SrDNA的分子雜技圖譜庫涵蓋了200個屬的1200多種6950株微生物，為各研究和實驗機構(gòu)提供了一個統(tǒng)一的微生物分型標準。為環(huán)境分離物、致病菌、有害生物體、質(zhì)控菌株、有益生物體和任何細菌建立了一個全自動的基因指紋圖庫。這一精確到菌株水平的鑒定系統(tǒng)能夠追溯細菌污染源，并且具有對所有微生物環(huán)境進行控制及流行病學(xué)調(diào)查等強大功能。當前26頁，總共89頁。a)近紅外傅立葉光譜分析b)色譜分析物質(zhì)成分分析當前27頁，總共89頁。紅外傅立葉光譜分析FT-IR技術(shù)以未損傷細胞的FT-IR光譜的特殊指紋區(qū)為基礎(chǔ)，光譜反映的是整個細胞組成分子的振動特征，也就是蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的特征由于這些細胞組分與基因表達有關(guān)，反應(yīng)了全細胞組分的綜合信息所得圖譜有效地反映了細胞表型和基因型信息，從而區(qū)分生化信息上的差別德國Bruker公司微生物FT-IR分析用戶手冊主要采用1200-900ｃｍ-1，3000-2800ｃｍ-1，1500-1400ｃｍ-1譜段組合進行微生物判別分析，這3個譜段分別主要代表了微生物細胞壁多聚糖、細胞膜脂肪酸以及細胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)和類脂成分的信息。當前28頁，總共89頁。色譜分析微生物中含有的一些稱為生物標志物的化學(xué)物質(zhì)，其含量或結(jié)構(gòu)具有種屬特征或與其分類位置密切相關(guān)通過分析微生物的化學(xué)組成鑒定微生物，開辟了一個微生物檢測和鑒定的新途徑高效液相色譜(High-performanceliquidchromatography，HPLC)氣相色譜(Gaschromatography，GC)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(Gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)建立各種生物標志物在微生物中分布情況的數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)的標準分析程序，仍然是色譜分析微生物的主要方向當前29頁，總共89頁。2.1技術(shù)手段2.2方法比較當前30頁，總共89頁。各種鑒定方法的比較我所抗生素室通過比較分析近百種微生物的生化鑒定方法（API和VITEK2鑒定）和分子生物學(xué)方法鑒定方法，客觀準確的多方面評價各種方法的優(yōu)劣當前31頁，總共89頁。微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用四微生物污染監(jiān)管方式的思考五背景介紹一當前32頁，總共89頁。3.1細菌鑒定3.2溯源分析當前33頁，總共89頁。3.1細菌鑒定3.2溯源分析當前34頁，總共89頁。3.1細菌鑒定3.2溯源分析當前35頁，總共89頁。微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用四微生物污染監(jiān)管方式的思考五背景介紹一當前36頁，總共89頁。四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用

增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，國際認可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力與國際標準接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.4當前37頁，總共89頁。四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用

增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，國際認可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力與國際標準接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.4當前38頁，總共89頁。微生物檢測實驗室應(yīng)首先確保實驗室的設(shè)施和環(huán)境不會對檢驗過程帶來微生物污染只有排除檢測過程中的微生物污染，才能保證檢驗結(jié)果的準確性，才能有足夠的理由相信，樣品污染來自藥品本身，而不在檢驗過程中被污染的對檢測機構(gòu)而言，自身檢測環(huán)境的控制要比樣品檢測更加重要四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用

當前39頁，總共89頁。公正準確科學(xué)高效當前40頁，總共89頁。加強檢測的“過程控制”建立實驗室環(huán)境微生物信息庫、動態(tài)監(jiān)控環(huán)境微生物的變化、建立環(huán)境微生物污染趨勢分析圖，預(yù)測微生物污染方向，從被動的排查污染措施上升到主動的預(yù)防、預(yù)警。如果樣品檢驗過程中不合格，分離鑒定樣品中的微生物，與環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫比較、分析微生物污染來源，出具客觀的檢測報告，杜絕實驗結(jié)果假陽性和假陰性的發(fā)生當前41頁，總共89頁。樣品接收樣品擺放樣品分發(fā)環(huán)境設(shè)施儀器實驗過程結(jié)果報告①登記樣品名稱，檢查是否具有唯一性標識，并檢查是否與運轉(zhuǎn)表內(nèi)容一致②看樣品外包裝是否完整、密封,是否能保持無菌狀態(tài)符合檢驗要求③樣品數(shù)量是否符合檢驗要求樣品接收原始記錄原始記錄審核檢測過程控制當前42頁，總共89頁。樣品分發(fā)環(huán)境設(shè)施儀器實驗過程結(jié)果報告①根據(jù)樣品的貯存條件進行冷藏、冷凍或常溫放置②將樣品分區(qū)域（在檢、待檢、檢畢）擺置③冰箱和冰柜的溫度記錄樣品擺放樣品擺放樣品接收原始記錄原始記錄審核檢測過程控制當前43頁，總共89頁。環(huán)境設(shè)施儀器實驗過程結(jié)果報告①環(huán)境和設(shè)施等的質(zhì)量管理②儀器狀態(tài)是否正常（是否在計量標志的有效期內(nèi)）③做好儀器使用記錄儀器設(shè)施環(huán)境樣品接收樣品擺放樣品分發(fā)原始記錄原始記錄審核檢測過程控制當前44頁，總共89頁。樣品分發(fā)環(huán)境設(shè)施儀器實驗過程結(jié)果報告核對質(zhì)量標準是否現(xiàn)行有效培養(yǎng)基的質(zhì)量評估工作的審查關(guān)鍵步驟用試劑的質(zhì)量控制陽性對照菌的管理留樣管理廢棄物管理對滅菌效果評價的審查實驗過程質(zhì)量控制管理（人員技術(shù)能力，方法比對實驗，人員比對實驗，制備質(zhì)控樣品加菌隨行檢查）應(yīng)急事件處理程序?qū)嶒炦^程樣品接收樣品擺放原始記錄原始記錄審核檢測過程控制當前45頁，總共89頁。樣品分發(fā)環(huán)境設(shè)施儀器實驗過程結(jié)果報告①完全按SOP書寫，所寫即所做的內(nèi)容②統(tǒng)一原始記錄的格式和內(nèi)容③按既定期限完成原始記錄的書寫④按不同來源分別輸入結(jié)果原始記錄樣品接收樣品擺放原始記錄原始記錄審核檢測過程控制當前46頁，總共89頁。樣品分發(fā)環(huán)境設(shè)施儀器實驗過程結(jié)果報告①原始記錄的完整性②檢驗數(shù)據(jù)的正確性③結(jié)果判斷的合理性原始記錄審核樣品接收樣品擺放原始記錄審核原始記錄檢測過程控制當前47頁，總共89頁。樣品分發(fā)環(huán)境設(shè)施儀器實驗過程結(jié)果報告陰性結(jié)果直接報告陽性結(jié)果→鑒定結(jié)果報告樣品接收樣品擺放原始記錄原始記錄審核檢測過程控制當前48頁，總共89頁。建立環(huán)境微生物菌株信息庫實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控當前49頁，總共89頁。頭狀葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）常見潔凈環(huán)境微生物污染當前50頁，總共89頁。

實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控建立實驗室潔凈區(qū)采樣方案《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》（GB/T16292~16294—1996）《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（1998）以一個月為周期，連續(xù)監(jiān)測實驗室環(huán)境不定期對無菌室潔凈環(huán)境進行抽樣調(diào)查，積累潔凈環(huán)境微生物種群和分布數(shù)據(jù)檢查內(nèi)容包括沉降菌檢測、浮游菌檢測、表面微生物檢測和操作人員衛(wèi)生檢測等當前51頁，總共89頁。在實驗環(huán)境中以葡萄球菌屬（Staphylococcus）分離數(shù)目最多為34%微球菌屬（Micrococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）次之，分別為19.15%和17.04%假單胞菌屬（Micrococcus）、莫拉菌群（Moraxella）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）占4.26%短桿菌屬（Brevibacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、泛菌屬（Pantoea）等所占比例歸于其他項中收集的環(huán)境微生物中酵母菌占8.51%，主要為近平滑假絲酵母（Candidaparapsilosis）和粘紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa）霉菌等絲狀真菌占4.26%，主要為青霉菌屬我所實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控當前52頁，總共89頁。當前53頁，總共89頁。

我所環(huán)境微生物菌株信息庫的建立我們連續(xù)三個月對實驗室潔凈環(huán)境中部分環(huán)境微生物進行追蹤，并進行同源性分析當前54頁，總共89頁。以葡萄球菌屬為例，本實驗室共收集到16株葡萄球球菌屬細菌。7、8月分別收集到的細菌239與250和232與246之間同源性較高，歸在一個子類中，屬于同源污染。說明7月和8月之間的消毒滅菌過程不徹底，存在消毒漏洞。經(jīng)過消毒，在9月份監(jiān)測過程中收集到的葡萄球菌中未發(fā)現(xiàn)有和前兩月同源的菌株，說明前期的污染已經(jīng)消除，9月份收集到的部分葡萄球菌為新進入環(huán)境的微生物。當前55頁，總共89頁。同一株菌反復(fù)污染潔凈環(huán)境要引起檢驗人員高度重視僅靠潔凈室內(nèi)部消毒措施很可能起不到排除污染的作用要對潔凈室送風(fēng)系統(tǒng)和檢驗人員攜帶污染進行全面調(diào)查建立環(huán)境微生物污染趨勢分析圖，預(yù)測微生物污染方向，從被動的排查污染措施上升到主動的預(yù)防、預(yù)警。將污染信息并與歷史污染物比對，回顧調(diào)查，幫助質(zhì)量體系的改進。當前56頁，總共89頁。微生物進行鑒定菌株來源共241株當前57頁，總共89頁。四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用

增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰Γ龅綌?shù)據(jù)可信，國際認可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力與國際標準接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.4當前58頁，總共89頁。

在藥品微生物檢驗中的應(yīng)用在嚴格依據(jù)法定方法進行檢驗的同時，結(jié)合微生物鑒定技術(shù)平臺，對檢驗過程和檢驗結(jié)果進行雙重復(fù)合和監(jiān)控。通過對比環(huán)境監(jiān)測的微生物種群類別和樣品微生物種群情況，客觀準確的評價檢驗質(zhì)量，增菌檢驗報告的含金量。當前59頁，總共89頁。在細菌污染檢查中的應(yīng)用當前60頁，總共89頁。分離純化得到單菌落菌落形態(tài)檢驗DNA提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)鑒定通用引物擴增細菌16SrDNA

序列16SrDNA序列分析鑒定結(jié)論樣品接收革蘭氏染色API鑒定形態(tài)鑒定生化鑒定VITEK鑒定細菌的鑒定流程圖

當前61頁，總共89頁。在真菌污染檢查中的應(yīng)用當前62頁，總共89頁。

在真菌污染檢查中的應(yīng)用現(xiàn)行國標僅能夠?qū)η箤?，青霉屬，鐮刀菌屬等少?shù)幾個種屬的霉菌進行鑒定。我國的食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗國家標準中，對于青霉菌的鑒定需要在分離純化后培養(yǎng)12-14天，再對其孢子及菌絲進行形態(tài)學(xué)觀察。真菌孢子易于在空氣中飄散，難以殺滅，對實驗室環(huán)境和檢驗人員安全具有潛在污染風(fēng)險。分子生物學(xué)鑒定技術(shù)有效的解決了區(qū)分污染來源的問題。該方法不需要使用選擇性培養(yǎng)基，純化后即可進行菌種鑒定。對真菌的菌絲體和孢子均能夠進行DNA的提取，避免霉菌產(chǎn)生的大量孢子對實驗室工作環(huán)境帶來的潛在污染危害當前63頁，總共89頁。真菌的鑒定流程圖分離純化得到真菌樣品的單菌落真菌菌落形態(tài)觀察真菌DNA的提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)評價通用引物擴增真菌ITS序列ITS序列在GenBank中進行Blast分析鑒定結(jié)論當前64頁，總共89頁。四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用

增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，國際認可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力與國際標準接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.4當前65頁，總共89頁。美國FDA在要求藥廠將微生物鑒定到“種”一級，并建議在微生物形態(tài)和生化反應(yīng)鑒定之外采用基因分型技術(shù)進行分析，以便對生產(chǎn)環(huán)境的微生物污染進行監(jiān)控對藥廠生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)管和風(fēng)險評估上應(yīng)用當前66頁，總共89頁。上海某藥業(yè)產(chǎn)品受微生物潛在污染風(fēng)險上海某藥業(yè)有限公司無菌產(chǎn)品微生物污染溯源某醫(yī)療器材有限公司滅菌方法研究對藥廠生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)管和風(fēng)險評估上應(yīng)用當前67頁，總共89頁。某制藥廠沉降菌同源性分析當前68頁，總共89頁。當前69頁，總共89頁。檢測實驗室微生物信息庫制藥企業(yè)微生物信息庫同源性分析比對污染源是否微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用鑒定當前70頁，總共89頁。四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用

增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，國際認可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力與國際標準接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.4當前71頁，總共89頁。4.4應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，可進行產(chǎn)品真?zhèn)舞b別和致敏原檢測國際上普遍加強了有關(guān)食品標簽的法律法規(guī)，對相關(guān)標準不斷細化。越來越多國家和地區(qū)開始全面實施對食品致敏原成分加以標識的規(guī)定酶聯(lián)免疫技術(shù)PCR技術(shù)等動植物產(chǎn)品的真?zhèn)舞b定追蹤產(chǎn)品產(chǎn)地鑒別產(chǎn)品主要組成成分PCR技術(shù)在致敏原檢測中具有較高的檢出率，能檢測樣品中ppm級的致敏原物質(zhì)當前72頁，總共89頁。微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二樣品微生物的鑒定及同源性分析三微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用四微生物污染監(jiān)管方式的思考五背景介紹一當前73頁，總共89頁。企業(yè)自查政府監(jiān)管微生物樣本的采集微生物菌株鑒定企業(yè)環(huán)境控制及污染溯源能力新型監(jiān)管模式的建立構(gòu)建微生物分布圖建立菌種信息庫

A類企業(yè)：分子水平B類企業(yè)：生化水平C類企業(yè)：境檢、API水平企業(yè)－－微生物鑒定到“屬”藥檢所－－－鑒定到“種”

“菌珠”五、上海醫(yī)藥企業(yè)微生物污染的監(jiān)督、管理和風(fēng)險評估新模式的建立－－－新的監(jiān)管模式流程圖當前74頁，總共89頁。

新的監(jiān)管模式流程圖食品藥品監(jiān)督管理局科學(xué)規(guī)劃企業(yè)內(nèi)部自查局各職能部門外部督察藥檢所強大的技術(shù)支撐

上海醫(yī)藥企業(yè)微生物污染的信息庫監(jiān)督、管理和風(fēng)險評估當前75頁，總共89頁。完善對制藥企業(yè)的風(fēng)險分級監(jiān)管建立和健全日常監(jiān)督檢查方法強化企業(yè)微生物風(fēng)險管理意識建立藥品污染源通報、追蹤平臺，完善藥品召回機制5.15.25.35.4幫助企業(yè)改進產(chǎn)品質(zhì)量，打造醫(yī)藥安全公共研發(fā)平臺5.5五、上海醫(yī)藥企業(yè)微生物污染的監(jiān)督、管理和風(fēng)險評估新模式的建立當前76頁，總共89頁。5.1完善對制藥企業(yè)的風(fēng)險分級監(jiān)管對制藥企業(yè)分級管理往往依據(jù)藥品的產(chǎn)量、使用頻次及以往的污染事件嚴重性，對生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)環(huán)境缺乏有效的數(shù)據(jù)監(jiān)測，容易忽略潛在的微生物污染危害要是對文件資料的審查和經(jīng)驗性的對加工條件和過程的評判，缺乏對微生物污染進行監(jiān)控和調(diào)查的手段，僅能對生產(chǎn)環(huán)境和終產(chǎn)品的細菌總數(shù)和控制菌進行檢查，缺乏量化的評價指標檢測機構(gòu)對微生物檢測和追蹤識別能力大幅提高通過采用微生物鑒定和分型技術(shù)對藥品加工全過程的監(jiān)控，能對微生物污染來源進行詳細的分析，繪制工廠微生物分布圖，了解工廠生產(chǎn)過程中的污染重災(zāi)區(qū)和引起污染的工藝步驟為建立更全面的藥品質(zhì)量體系和風(fēng)險管理體系提供了有效的分析手段。增強了監(jiān)管部門對制藥企業(yè)的監(jiān)管力度和檢查能力傳統(tǒng)監(jiān)管方法新監(jiān)管方法當前77頁，總共89頁。上海共有制藥企業(yè)約200家上海地區(qū)被列為重點監(jiān)控對象的注射劑、生物制品和特殊藥品三類高風(fēng)險品種的生產(chǎn)企業(yè)僅有58家將臨時性的整頓深化為常態(tài)性的管理，可以使監(jiān)管部門快速應(yīng)對微生物性污染突發(fā)事件，為有效評估污染源的危害和范圍提供詳盡的第一手分析資料這些品種涉及范圍廣、產(chǎn)品使用頻繁，且容易發(fā)生微生物性藥品污染事件。逐步提高上海地區(qū)制藥企業(yè)的微生物性污染的風(fēng)險管理水平。當前78頁，總共89頁。上海地區(qū)高危企業(yè)微生物污染監(jiān)管方式的思考

1、調(diào)研：掌握企業(yè)生產(chǎn)管理水平和微生物風(fēng)險管理能力

企業(yè)基本情況調(diào)查

微生物污染情況現(xiàn)場調(diào)查

企業(yè)微生物風(fēng)險管理水平等級劃分

制訂適合處于不同風(fēng)險理水平制藥企業(yè)管理措施和改進意見

2、完善藥品微生物污染風(fēng)險管理體系，制定切實可行的日常微生物監(jiān)控網(wǎng)和風(fēng)險防范、預(yù)警機制。

對制藥企業(yè)微生物污染的控制相關(guān)從業(yè)人員進行有計劃的指導(dǎo)和培訓(xùn)

為各類企業(yè)設(shè)定微生物風(fēng)險控制水平目標，幫助企業(yè)建立微生物自查、預(yù)警和防護體系

建設(shè)微生物污染監(jiān)控數(shù)據(jù)庫，為藥品監(jiān)管部門提供監(jiān)管依據(jù)，建立藥品安全監(jiān)管長效機制當前79頁，總共89頁。對有條件的A類企業(yè)：要具備一定的分子生物學(xué)鑒定方法和完備的生化鑒定手段，能對環(huán)境微生物給出基本準確度鑒定結(jié)果；對B類企業(yè)：要具備完善的生化鑒定體系，要能給出可靠的微生物生化譜；對C類企業(yè)：基本要具有API試劑條鑒定條件和形態(tài)分析能力。

逐步規(guī)范企業(yè)生產(chǎn)行為，將風(fēng)險預(yù)警步驟前移至企業(yè)日常生產(chǎn)過程，并設(shè)立考核指標和文件記錄體制，對監(jiān)管部門常規(guī)檢查提供資料和考核標準。當前80頁，總共89頁。5.2建立和健全日常監(jiān)督檢查方法覆蓋從原料到終產(chǎn)品的全過程監(jiān)控對空氣采樣共設(shè)置16個采樣點，同時增設(shè)表面微生物采樣點表面細菌的測定采用平板接觸法，包括房間的門把手、操作人員操作服胸口和前臂處、手套、口罩、拖鞋底等微生物隨著操作人員更容易進潔凈環(huán)境，最可能成為污染的主要來源當前81頁，總共89頁。現(xiàn)階段微生物檢驗技術(shù)突飛猛進，許多先進的檢測方法經(jīng)過了實踐和時間的檢驗，已經(jīng)具備了普及的條件在中國，許多技術(shù)已經(jīng)被國家標準吸收和引進，如