衛(wèi)生化學(xué)教學(xué)課件：第四章 紫外-可見(jiàn)分光光度法

第四章紫外-可見(jiàn)分光光度法第一節(jié)基本原理電磁波和電磁波譜紫外可見(jiàn)吸收光譜的產(chǎn)生吸收光譜特征和與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系第四章紫外—可見(jiàn)分光光度法案例：上個(gè)世紀(jì)90年代，“膽紅素”是十分昂貴的制藥原料，它從新鮮豬苦膽的膽汁中提取。給豬注射苯肼可促使膽汁分泌，但苯肼在豬體內(nèi)代謝產(chǎn)生芳基化合物，因此，注射苯肼的豬肉-“黃膘肉”不能上市買(mǎi)賣(mài)。檢測(cè)芳基化合物并不難，但既要做到分析快速準(zhǔn)確，又要安全，簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉卻比較困難，于是分析工作者選擇了紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行“黃膘豬”芳基化合物快速檢測(cè)。每個(gè)樣品從取樣到檢測(cè)只需要幾分鐘。1、紫外-可見(jiàn)分光光度法屬于什么分析方法？具備哪些特點(diǎn)？2、它的基本原理是什么？3、為什么這次“黃膘豬”事件不采用化學(xué)分析方法？光譜分析法：

指利用物質(zhì)與輻射能作用時(shí)所吸收或發(fā)射輻射的特征和強(qiáng)度建立起來(lái)的定性、定量及結(jié)構(gòu)分析方法。分類(lèi)：按照物質(zhì)粒子的類(lèi)型分：原子光譜法、分子光譜法。按物質(zhì)內(nèi)部能級(jí)的躍遷方向：吸收光譜法、發(fā)射光譜法。按輻射的波長(zhǎng)：射線、射線、紫外-可見(jiàn)紅外光譜法等。

紫外可見(jiàn)分光光度法（吸收光譜法）是根據(jù)溶液中物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外-可見(jiàn)光譜區(qū)電磁輻射的吸收特征和吸收程度而建立起來(lái)的定性和定量的分析方法。

可見(jiàn)光區(qū)：波長(zhǎng)400-760nm

紫外光區(qū)：波長(zhǎng)200-400nm

它是光譜分析的一種。具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，檢出限可達(dá)10-7g/ml，相對(duì)誤差通常為1%-5%。該方法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、易于掌握和推廣，是常用分析方法之一。一、電磁輻射與電磁波譜第一節(jié)紫外可見(jiàn)基本原理無(wú)線電波微波紅外光可見(jiàn)光紫外光X射線射線光是一種電磁波,包括：射線x射線紫外光紅外光微波無(wú)線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm100cm103cm105可見(jiàn)光1m=103mm=106μm=109nm土星環(huán)結(jié)構(gòu)探測(cè)

氣象雷達(dá)探測(cè)微波爐是哪種電磁波？2.2μm1cm—1000cm12cm光具有波粒二象性：波動(dòng)性：折射、衍射、偏振及干涉等性質(zhì)粒子性：具有動(dòng)量，光電效應(yīng)。電磁波在真空中的傳播速度等于光速，即光由微粒組成，直線傳播光是一種波動(dòng)，具有一定波長(zhǎng)光子的能量與波長(zhǎng)的關(guān)系為：能量J或eVPlanck常數(shù)6.626×10-34J·s頻率，Hz光速2.998×108m/s波長(zhǎng)m例：計(jì)算波長(zhǎng)為200nm的光子的能量解：紫外-可見(jiàn)光區(qū)光子的能量和波長(zhǎng)的關(guān)系見(jiàn)下表：（nm）200300400500600760E（eV）6.204.133.102.482.071.63電磁波譜按能量不同可分為：無(wú)線電波1-1000m微波10-3-1m紅外0.76-1000m可見(jiàn)400-760nm紫外10-400nm近紫外200～400nm遠(yuǎn)紫外10～200nmX射線0.01-10nm本章重點(diǎn)討論

當(dāng)一束白光通過(guò)一個(gè)三棱鏡，我們可以看到白光是由許多顏色組成的，這種現(xiàn)象在rainbow中也可以看到。白光的波長(zhǎng)大約從400nm-760nm，人的眼睛對(duì)這個(gè)區(qū)域的光是敏感的，因此稱為可見(jiàn)光，可見(jiàn)光短波的一端是紫色，長(zhǎng)波的一端是紅色。小知識(shí)1.紫外-可見(jiàn)吸收光譜的產(chǎn)生光譜分析按物質(zhì)內(nèi)部能級(jí)躍遷的方向可分為吸收光譜和發(fā)射光譜。吸收光譜又可分為原子吸收光譜和分子吸收光譜。二、紫外—可見(jiàn)吸收光譜

物質(zhì)分子內(nèi)部有電子繞原子核的運(yùn)動(dòng)、原子在其平衡位置上的振動(dòng)、分子繞重心轉(zhuǎn)動(dòng)三種運(yùn)動(dòng)形式，相應(yīng)這三種不同的運(yùn)動(dòng)形式，分別對(duì)應(yīng)分子中的三種能級(jí)，即：電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。每個(gè)電子能級(jí)包含若干振動(dòng)能級(jí)，振動(dòng)能級(jí)又包含若干轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。能級(jí)均是不連續(xù)的，量子化的，分子吸收能量也是量子化的，即只吸收對(duì)于兩個(gè)能級(jí)差的能量：

電子能級(jí)差在1-20eV（60-1250nm）的，主要在紫外—可見(jiàn)區(qū)，由此產(chǎn)生的吸收光譜稱為紫外—可見(jiàn)光譜，又稱電子光譜。思考:為什么紫外-可見(jiàn)吸收光譜為帶狀光譜？

電子能級(jí)一般在1-20ev，設(shè)躍遷所需ΔEe=5ev，則根據(jù)公式λ=hc/ΔE=248nm.

分子振動(dòng)能級(jí)間隔ΔEν約比電子能級(jí)小10倍，一般在0.05-1ev.相當(dāng)于紅外光能量。設(shè)ΔEν=0.1ev，則為5ev能級(jí)間隔的2%。當(dāng)電子能級(jí)躍遷時(shí)，不可避免也要發(fā)生振動(dòng)躍遷，因此得到不只是248nm一條譜線，而是一系列譜線，彼此波長(zhǎng)間隔248*2%=5nm。分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間隔ΔEr比振動(dòng)能級(jí)小10-100倍，一般小于0.05ev，相當(dāng)于遠(yuǎn)紅外或微波能量。設(shè)ΔEr=0.005ev，請(qǐng)問(wèn)最終帶狀光譜彼此波長(zhǎng)間隔是多少納米？2.紫外-可見(jiàn)光譜及其特征

吸收光譜：測(cè)定某一溶液對(duì)紫外-可見(jiàn)光區(qū)不同波長(zhǎng)單色光吸光度，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制的圖形。它能更準(zhǔn)確地描述物質(zhì)對(duì)各種不同波長(zhǎng)光的吸收情況。吸收峰谷肩峰末端吸收吸收光譜的作用：峰形、λmax、摩爾吸光系數(shù)為定性分析的依據(jù)。定量分析時(shí)，用以確定合適的波長(zhǎng),一般選用λmax，原則為：吸收最大，干擾最小。思考：KMnO4呈現(xiàn)什么顏色，如何選用合適的吸收波長(zhǎng)？KMnO4溶液選擇性的吸收了525nm附近的綠青色光，而對(duì)與綠青色光互補(bǔ)的400nm附近的紫色光幾乎不吸收，所以KMnO4溶液呈紫紅色。1.物質(zhì)的顏色

當(dāng)一束白光通過(guò)棱鏡后就色散成紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等顏色的光，它們具有不同的波長(zhǎng)范圍。三、紫外-可見(jiàn)吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系白光紅650～750紫400～450藍(lán)450～480綠藍(lán)480～500綠500～560黃綠560～580黃580～600橙600～650互補(bǔ)光

反之，這些不同顏色的光按一定的強(qiáng)度比混合后便又形成白光。

進(jìn)一步的研究表明，只需將兩種適當(dāng)顏色的光按一定的強(qiáng)度比例混合即可形成白光，這兩種光稱為互補(bǔ)色光。陽(yáng)光、白熾燈光等白光就是由一對(duì)對(duì)互補(bǔ)色光按一定強(qiáng)度比例混合而成的。物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色吸收光顏色波長(zhǎng)范圍（nm）黃綠紫400—450黃藍(lán)450—480橙紅綠藍(lán)480—500紅紫綠500—560紫黃綠560—580藍(lán)黃580—600綠藍(lán)橙600—650藍(lán)綠紅650—750物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色與吸收光顏色的關(guān)系物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收

物質(zhì)的分子內(nèi)部具有一系列不連續(xù)的特征能級(jí)，包括電子、振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)，這些能級(jí)是量子化的。一般情況下，物質(zhì)分子處在能量最低、最穩(wěn)定的基態(tài)。當(dāng)用光照射某物質(zhì)后，如果光的能量恰好與物質(zhì)分子的某一能級(jí)差相等，這一波長(zhǎng)的光即可被分子吸收，從而使分子從基態(tài)躍遷小知識(shí)到激發(fā)態(tài)。這就是說(shuō)，并非任一波長(zhǎng)的光都可以被某一物質(zhì)所吸收。由于不同物質(zhì)的分子組成和結(jié)構(gòu)不同，它們所具有的特征能級(jí)也不同，能級(jí)差當(dāng)然也不同。物質(zhì)只能吸收與其分子內(nèi)部能級(jí)差相等的光，所以物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性。

物質(zhì)具有顏色，就是它對(duì)不同波長(zhǎng)的可見(jiàn)光具有選擇性吸收的結(jié)果。物質(zhì)呈現(xiàn)顏色與它所吸收光的顏色（波長(zhǎng)）有一定關(guān)系。物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過(guò)吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光

若物質(zhì)對(duì)白光中所有顏色的光全部吸收，它就呈現(xiàn)黑色；若反射所有顏色的光則呈現(xiàn)白色；若透過(guò)所有顏色的光，則為無(wú)色。若物質(zhì)不吸收（反射）某波長(zhǎng)的光，就呈現(xiàn)該波長(zhǎng)光的顏色。是真金，在哪里都會(huì)閃閃發(fā)光！短波部分散射人人眼；短波部分被大氣層散射

物質(zhì)顏色深淺決定于吸收光的量的多少，即取決于吸光物質(zhì)濃度的高低。如CuSO4溶液的濃度愈高，對(duì)黃色光的吸收就愈多，表現(xiàn)為透過(guò)的藍(lán)色光愈強(qiáng)，溶液的藍(lán)色愈深。

因此，可以通過(guò)比較溶液顏色的深淺來(lái)確定溶液中物質(zhì)的含量。物質(zhì)顏色深淺有什么決定呢？2.有機(jī)化合物的吸收光譜

有機(jī)化合物的吸收光譜是由分子外層電子躍遷而產(chǎn)生的。有機(jī)分子的軌道類(lèi)型及躍遷類(lèi)型如圖所示能量成鍵成鍵非成鍵反鍵反鍵n**→*→*n→*n→*分子中外層電子能級(jí)及躍遷類(lèi)型示意圖能量成鍵成鍵未成鍵反鍵反鍵n**→*→*n→*n→*1）→*躍遷鍵比較穩(wěn)定，即電子從成鍵軌道躍遷到*反鍵軌道，所需的能量很大。此能量相當(dāng)于遠(yuǎn)紫外區(qū)的輻射能。飽和烴只能發(fā)生→*躍遷，因而吸收光譜都在遠(yuǎn)紫外區(qū)。如甲烷的最大吸收波長(zhǎng)在125nm，乙烷在135nm。能量成鍵成鍵未成鍵反鍵反鍵n**→*→*n→*n→*2）n→*躍遷在含有雜原子（N、S、P、O）的飽和有機(jī)化合物分子中可發(fā)生n→*躍遷n→*躍遷所需的能量和→*躍遷所需的能量接近。如甲醇除有→*躍遷外，還有n→*躍遷，吸收波長(zhǎng)在183nm左右，在紫外區(qū)不易觀察到。未成鍵能量成鍵成鍵反鍵反鍵n**→*→*n→*n→*3）→*躍遷

不飽和有機(jī)化合物分子中存在、成鍵軌道和*、*反鍵軌道。有→*躍遷和→*躍遷?！?躍遷所需的能量較→*躍遷所需能量小。任何具有不飽和鍵的有機(jī)化合物均可發(fā)生→*躍遷，隨著→*共軛程度增加，吸收峰向長(zhǎng)波移動(dòng)。能量未成鍵成鍵成鍵反鍵反鍵n**→*→*n→*n→*4）n→*躍遷

若形成不飽和鍵的原子含有雜原子（N、S、P、O），則可發(fā)生n→*躍遷。n→*躍遷所需的能量較→*躍遷所需的能量更小。吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)，吸收峰一般位于近紫外區(qū)。如丙酮除有→*躍遷外，還有n→*躍遷，吸收波長(zhǎng)在280nm左右。綜上所述，各種電子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)所需的能量不同，次序?yàn)檫h(yuǎn)紫外區(qū)紫外-可見(jiàn)區(qū)生色團(tuán)有機(jī)化合物的UV-Vis光譜主要以

n→*和→*躍遷為基礎(chǔ)，這兩類(lèi)躍遷都要求化合物中含有不飽和官能團(tuán)以提供鍵，因此，把含有鍵的不飽和基團(tuán)稱為生色團(tuán)。你了解這些嗎？紅移雙鍵的n→*和→*躍遷所需的能量在200nm左右。如果有共軛雙鍵存在，因形成大鍵，使→*躍遷所需的能量降低，導(dǎo)致最大的吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，稱為紅移。共軛鏈愈長(zhǎng)，紅移現(xiàn)象愈顯著，甚至到可見(jiàn)光區(qū)呈現(xiàn)顏色。雙鍵化合物H(CH=CH)nH溶劑max/nmn=1己烯蒸汽162n=21,3-丁二烯正己烷217n=31,3,5-己三烯正己烷258n=41,3,5,7-辛四烯環(huán)己烷304n=51,3,5,7,9-癸五烯正辛烷334n=11-胡蘿卜素正己烷480共軛作用對(duì)烯烴最大吸收的影響紅移情況1溶劑極性增加，→*紅移增加醛、酮和羧酸中C=O雙鍵同C=C雙鍵的共軛作用也會(huì)降低*的的能量，從而使n→*和→*躍遷的吸收峰都發(fā)生紅移。如巴豆醛CH3CH=CHCH=O的乙醇溶液的吸收光譜在220nm處有一個(gè)由→*躍遷產(chǎn)生的吸收峰和在322nm處有一個(gè)由n→*躍遷產(chǎn)生的吸收峰。紅移情況2

單獨(dú)烯鍵的→*躍遷吸收峰在170nm附近，單獨(dú)羰基的→*躍遷吸收峰在166nm，n→*躍遷吸收峰在280nm。

芳香化合物的紫外光譜具有→*躍遷產(chǎn)生的三個(gè)特征吸收帶。如，苯在184nm、204nm處各有一吸收帶，在254nm處有一吸收帶（B帶），B吸收帶是由→*躍遷和苯環(huán)的振動(dòng)能級(jí)躍遷疊加而產(chǎn)生，具有很好的精細(xì)結(jié)構(gòu)，常用于芳香化合物的辨認(rèn)。苯的這三個(gè)特征吸收帶受苯環(huán)上取代基的影響會(huì)發(fā)生移動(dòng)。紅移情況3B化合物溶劑max苯2%甲醇254甲苯262氯苯264碘苯258苯酚271酚鹽離子286苯甲酸272苯胺280苯胺鹽離子254某些苯衍生物的吸收特性助色團(tuán)當(dāng)苯環(huán)上有-OH、-NH2等取代基時(shí)，吸收峰紅移，吸收強(qiáng)度增大。原因是這些基團(tuán)的n電子能同苯環(huán)上的π電子發(fā)生共軛作用，使*軌道能量降低。像這樣一些本身在紫外和可見(jiàn)區(qū)無(wú)吸收，但能使生色團(tuán)吸收峰紅移，吸收強(qiáng)度增大的基團(tuán)稱為助色團(tuán)。主要的助色團(tuán)有羥基、氨基、烷氧基。CHHHI→*躍遷150-210nmn→*躍遷259nmCH3ICH4的吸收峰125-135nmCH2I2和CHI3的吸收峰分別為292nm和349nm注意溶劑的極性對(duì)最大吸收波長(zhǎng)影響較大，在描述某化合物的吸收情況時(shí)應(yīng)注明溶劑。一般來(lái)說(shuō)，隨著溶劑極性的增大，→*吸收峰發(fā)生紅移，n→*躍遷吸收峰發(fā)生藍(lán)移（或紫移）。3.無(wú)機(jī)化合物的吸收光譜（1）d—d躍遷過(guò)渡金屬離子與配位體（有機(jī)）形成的配合物，吸收紫外可見(jiàn)光而形成的吸收光譜。如果配合物d軌道未充滿，當(dāng)吸收光通過(guò)時(shí)可發(fā)生d—d*躍遷，吸收波長(zhǎng)取決于配位場(chǎng)大小。H2O的配位場(chǎng)小于NH3特點(diǎn)：吸收強(qiáng)度小。（2）電荷遷移躍遷有些化合物同時(shí)具有電子給予體和電子接受體，吸收能量后，電子發(fā)生轉(zhuǎn)移。配體和金屬之間躍遷，一般是L→M，吸收波長(zhǎng)取決于L給電子和M接受電子能力。SCN-比Cl-易給電子，F(xiàn)eSCN2+，吸收波長(zhǎng)長(zhǎng)，在可見(jiàn)區(qū)，F(xiàn)eCl2+在紫外區(qū)。如AgBr等由于電荷轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的顏色。特點(diǎn)：無(wú)機(jī)化合物紫外可見(jiàn)吸收光譜，測(cè)定靈敏度高，實(shí)際工作中常用。常將M與某L（顯色劑）生成具有電荷遷移的配合物，然后進(jìn)行含量測(cè)定。第四章紫外-可見(jiàn)分光光度法第二節(jié)朗伯比爾定律朗伯比爾定律偏離定律的因素紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)構(gòu)成

主講人：徐厚君（一）郎伯-比爾（Lambert-Beer）定律1.透光度和吸光度

當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，一部分被吸收，一部分透過(guò)溶液，一部分被容器表面反射。光的吸收定律

設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，吸收光強(qiáng)度為Ia，透射光強(qiáng)度為It，反射光強(qiáng)度為Ir，則

在吸收光度分析中，通常將待測(cè)溶液和參比溶液分別置于同樣材料和厚度的容器中，讓強(qiáng)度為I0的單色光分別通過(guò)兩個(gè)容器，再測(cè)量透射光強(qiáng)度。這樣，反射光的強(qiáng)度基本相同，其影響可以互相抵消，則如何消去Ir項(xiàng)？

當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液后，由于吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就會(huì)減弱。當(dāng)光透過(guò)濃度為c，液層厚度為b的溶液時(shí)，由于一部分光被吸收，因此透光度隨著溶液濃度和液層厚度的增加，光被吸收的程度增加，透射光的強(qiáng)度減小。透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度之比稱為透光度（transmittance），用T表示：

例如，入射光的強(qiáng)度為100，透射光的強(qiáng)度為35，則T=0.35或35%。

溶液的透光率愈大，表示它對(duì)光的吸收程度愈?。幌喾矗腹饴视?，對(duì)光的吸收程度愈大。

實(shí)踐證明，溶液對(duì)光的吸收程度與溶液濃度、液層厚度及入射光波長(zhǎng)等因素有關(guān)。如果保持入射光不變，則溶液對(duì)光的吸收程度只與溶液濃度c和液層厚度b有關(guān)，即吸光度吸光度（absorbance）吸光系數(shù)液層厚度溶液濃度當(dāng)K、c一定時(shí)，A∝bLambert’slaw當(dāng)K、b一定時(shí)，A∝cBeer’slawLambert-Beer定律是均勻、非散射介質(zhì)對(duì)光吸收的基本定律，只有對(duì)入射光是單色光才完全適用。比例常數(shù)K隨溶液濃度c和液層厚度b的單位不同而不同。2.吸光系數(shù)、比吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù)關(guān)系①a為吸光系數(shù)absorptivity

指在一定入射光波長(zhǎng)下，單位濃度及單位液層厚度時(shí)的吸光度。a代替K，即：此時(shí)一般b的單位為cm，c用g/L表示,a單位為L(zhǎng)/（g.cm）

摩爾吸光系數(shù)是指一定波長(zhǎng)時(shí)，溶液濃度c為1mol/L，液層厚度b為1cm時(shí)的吸光度，用表示。其單位為L(zhǎng)/(mol.cm)②摩爾吸光系數(shù)molarabsorptivity

③比吸光系數(shù)specificabsorptivity

比吸光系數(shù)是指一定波長(zhǎng)時(shí)，溶液濃度為1%（m/V），厚度為1cm的吸光度，用表示，其單位為100ml/（g.cm）

吸光系數(shù)與溶液濃度和液層厚度無(wú)關(guān)，與吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射波長(zhǎng)、溶劑等因素有關(guān)，可用作定性參數(shù)。定量分析時(shí)評(píng)價(jià)分光光度的靈敏度，越大，分析方法的靈敏度越高。是選擇顯色反應(yīng)的重要依據(jù)。三者之間的關(guān)系：例題：以鄰二氮菲光度法測(cè)定鐵的含量,稱取稱取0.5000g，經(jīng)處理后最后定容至50.00ml，在波長(zhǎng)510nm處用1cm比色皿測(cè)的吸光度為0.430，求試樣中鐵的百分含量。（，F(xiàn)e的原子量：56.85）解：解：例題：稱取1.00mg維生素B12(M=1355)，配成25.00ml水溶液，吸收池厚度為0.5cm，在361nm波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度為0.414，計(jì)算摩爾吸光系數(shù)。與物質(zhì)的本性、溶劑和入射光的波長(zhǎng)有關(guān)，即物質(zhì)不同，不同，是物質(zhì)的特性常數(shù)。溶劑不同，同一物質(zhì)的不同，所以應(yīng)注明溶劑。不同，同一物質(zhì)的吸收系數(shù)也不同，所以吸收系數(shù)應(yīng)注明波長(zhǎng)；（二）偏離比爾定律的因素（標(biāo)準(zhǔn)曲線彎曲）：

Ac（二）偏離比爾定律的因素（標(biāo)準(zhǔn)曲線彎曲）：光學(xué)因素的影響（1）非單色光的影響(負(fù)偏差)（2）雜散光的影響（正偏差）（3）狹縫寬度的影響

入射光的純度：?jiǎn)紊馐墙?jīng)單色器色散成波長(zhǎng)范圍很窄的光。實(shí)際上，不管單色器的分辨率有多高，所謂的單色光仍然是有一定的寬度的。例如高錳酸鉀溶液的吸收曲線。

如果在AB范圍內(nèi)，-1700，CD范圍內(nèi)-2300，EF范圍-2500。因此，還應(yīng)考慮單色光的純度，即使用儀器的精確度（光強(qiáng)和色散元件的分辨率）。cbλ1I02I01I2I1λ2復(fù)合光對(duì)Beer定律的偏離（1）

（2）當(dāng)兩束光線同時(shí)通過(guò)溶液時(shí)，有：帶入（1）（2）得設(shè)I01=I02，令ε2-ε1=Δε（1）當(dāng)Δε=0λ1=λ2直線（2）當(dāng)Δε>0ε2>ε1

隨c增大A3增大（3）當(dāng)Δε<0ε2<ε1

隨c增大A3減小雜散光(straylight)不該有光的地方有光，這就是雜散光?！话刺茁烦雠频墓?，就叫雜散光。

由于機(jī)械制造誤差引起的雜散光從透鏡邊緣射入。

狹縫寬度的影響：狹縫越窄，單色光越純，吸光度增加；但同時(shí)輻射能減小，對(duì)于弱吸收帶測(cè)量的靈敏性有一定影響。定性分析，一般采用較小狹縫，提高分辨能力；定量分析，在靈敏度允許的情況下，宜采用較大狹縫。溶液的物理及化學(xué)因素的影響溶液濃度過(guò)高：相鄰質(zhì)點(diǎn)電荷影響溶液的均勻性差：折射、散射或散射的影響

第二節(jié)紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的類(lèi)型很多，但其原理基本相似。一般由五部分構(gòu)成。光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示一、分光光度計(jì)的主要部件1.光源對(duì)光源基本要求：足夠光強(qiáng)、穩(wěn)定、連續(xù)輻射且強(qiáng)度隨波長(zhǎng)變化小。

氫燈和氘燈：150-400nm，采用石英窗口，氘燈的壽命和強(qiáng)度是氫燈3-5倍。

鎢及鹵鎢燈：350-2500nm，多用在可見(jiàn)光區(qū)。2.單色器

單色器的用途就是把混合光變成單色光，由入射狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件、聚焦元件和出口狹縫組成。常用的色散元件有棱鏡和光柵。

棱鏡是利用不同波長(zhǎng)的光具有不同的折射率而使復(fù)合光分開(kāi)的。用玻璃或石英制成。光柵grating

利用光的衍射和干涉作用使復(fù)合光分開(kāi)。其特點(diǎn)是：色散波長(zhǎng)范圍寬，可用于紫外、可見(jiàn)、紅外等光譜區(qū)，分辨率高，色散率基本上不隨波長(zhǎng)改變而改變，即均勻色散（色散近于線性）?，F(xiàn)代儀器多用光柵作色柵元件。光譜易重疊?？p狹縫狹是單色器的組成部分，對(duì)單色光的純度起著非常重要的作用。狹縫有兩種表示方法（1）用狹縫的實(shí)際寬度表示，以mm為單位，一般為0-2mm，（2）用通過(guò)出射狹縫的譜帶寬度表示，以nm為單位，如2nm、1nm、0.5nm及0.2nm等。狹縫愈窄，光的單色性愈好，測(cè)得的吸收峰愈尖銳，但光強(qiáng)度減弱，測(cè)定靈敏度降低。轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡或光柵，可使光譜移動(dòng)，使不同波長(zhǎng)單色光，從出射狹縫射出。3.吸收池absorptioncell比色皿cuvette

盛放樣品溶液的容器，用玻璃或石英制成，兩透光面互相平行，具有精確的光程。注意：紫外區(qū)用石英、可見(jiàn)區(qū)用玻璃或石英。盛放參比的吸收池和盛放樣品的吸收池應(yīng)匹配，即有相同的厚度與透光性。吸收池的光學(xué)面應(yīng)垂直于光束方向。使用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行校正（透光度之差小于0.5%）常規(guī)吸收池b=1cm，V=5ml微型吸收池b=4cm，V=2ml多光路吸收池光束檢測(cè)器4.檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)進(jìn)行檢測(cè)。（1）光電管利用光電效應(yīng)的原理。光電流通過(guò)負(fù)載電阻R，將電流變成電壓信號(hào)，經(jīng)放大器放大后，輸給記錄儀。

暗電流電極的熱電子發(fā)射而產(chǎn)生的電流。暗電流愈小愈好。在分光光度計(jì)中，都設(shè)有補(bǔ)償電路，消除暗電流。光電管有兩種：紫敏光電管，為銫陰極，適用波長(zhǎng)200-625nm；紅光電敏管，為銀氧化銫，適用波長(zhǎng)625-1000nm。

（2）光電倍增管（3）光二極管陣列檢測(cè)器photo-diodearraydetector

光電二極管陣列檢測(cè)器是在晶體硅上緊密排列一系列光二極管，如HP8452A型，在190-820nm，由316個(gè)二極管，當(dāng)光透過(guò)晶體硅時(shí)，二極管輸出的電訊號(hào)強(qiáng)度與光強(qiáng)度成正比。每一個(gè)二極管相當(dāng)于一個(gè)單色儀的出口狹縫，兩個(gè)二極管中心距離的波長(zhǎng)范圍，稱為采樣間隔，二極管愈多，分辨率愈高，每個(gè)二極管可在1/10s，每隔2nm測(cè)一次，同時(shí)并行采集數(shù)據(jù)，在1/10s時(shí)間內(nèi)，可獲全光譜。5.信號(hào)處理與顯示裝置光電管輸出的信號(hào)很弱，經(jīng)過(guò)放大后才能以某種方式將測(cè)量結(jié)果顯示出來(lái)。信號(hào)處理包括一些數(shù)學(xué)運(yùn)算。顯示器可由電表、數(shù)字顯示、熒光屏顯示、結(jié)果打印、曲線掃描等。顯示方式有T、A，有的還可以轉(zhuǎn)換成濃度，ε等。第四章紫外-可見(jiàn)分光光度法第三節(jié)分析條件的選擇第四節(jié)定性和定量分析分光光度計(jì)的類(lèi)型測(cè)量條件和顯色條件的選擇定性分析和定量分析

主講人：徐厚君二、分光光度計(jì)的類(lèi)型按不同的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)喂馐碗p光束；單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)；可見(jiàn)、紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)。1.單光束分光光度計(jì)單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)比值光源單色器吸收池s檢測(cè)器顯示光束分裂器切光器旋轉(zhuǎn)很快，光強(qiáng)I0不會(huì)影響A3.雙波長(zhǎng)分光度計(jì)雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)示意圖通過(guò)切光器使兩束不同波長(zhǎng)的光交替通過(guò)吸收池，測(cè)得吸光度差A(yù)。SB1和SB2分別為在1和2處的背景吸收，當(dāng)1和2

相近時(shí)，背景吸收近似相等。二式相減，得

這表明，試樣溶液濃度與兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光光差成正比。特點(diǎn)：可測(cè)多組份試樣、混濁試樣、而且可作成導(dǎo)數(shù)光譜、不需參比液(消除了由于參比池的不同和制備空白溶液等產(chǎn)生的誤差)、克服了電源不穩(wěn)而產(chǎn)生的誤差，靈敏度高。第三節(jié)分析條件的選擇

在分析中，選擇最佳的分析條件可使測(cè)定結(jié)果具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。主要包括溶劑選擇、顯色反應(yīng)、測(cè)量條件。溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)應(yīng)無(wú)明顯吸收。在溶解度允許的范圍內(nèi)，盡量選擇極性較小的溶劑。溶劑應(yīng)能很好地溶解被測(cè)試樣，溶劑對(duì)溶質(zhì)應(yīng)該是惰性的。即所成溶液應(yīng)具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性。一、溶劑的選擇二、顯色反應(yīng)及反應(yīng)條件的選擇

在可見(jiàn)光區(qū)進(jìn)行測(cè)定有很多方便之處。如果待測(cè)物本身有色，可直接進(jìn)行測(cè)定；如果待測(cè)物無(wú)色或顏色較淺，則往往通過(guò)顯色反應(yīng)使待測(cè)物成為在可見(jiàn)區(qū)有吸收的物質(zhì)。

能與無(wú)色物質(zhì)反應(yīng)生成有色物質(zhì)的試劑稱為顯色劑，生成有色物質(zhì)的反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)，即待測(cè)組分顯色劑有色化合物顯色反應(yīng)1.對(duì)顯色反應(yīng)的要求

待測(cè)組分與顯色劑定量的轉(zhuǎn)變成有色化合物，二者又確定的化學(xué)計(jì)量關(guān)系。有色化合物的組成恒定，有足夠的穩(wěn)定性，摩爾吸光系數(shù)較大（104以上）。生成的有色物應(yīng)具有較大的，即具有較高的靈敏度。A的最佳范圍為0.2-0.8，則c最低為多少。若＜2×104，可考慮用光程長(zhǎng)的吸收池。若c＝10-6mol/L，則應(yīng)大于1×105。

有色化合物與顯色劑之間的顏色要有明顯的差別。顯色時(shí)的顏色變化明顯，試劑空白值小。

選擇性好，干擾少或干擾易消除。顯色劑只與待測(cè)組分或少數(shù)干擾組分生成有色物質(zhì)；或顯色劑與待測(cè)組分生成的物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)與顯色劑與干擾組分生成的物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)相差較大。通過(guò)控制條件防止干擾組分與顯色劑發(fā)生反應(yīng)。

為了滿足以上要求，必須控制反應(yīng)條件。2.顯色反應(yīng)條件的選擇

顯色反應(yīng)能否滿足上述要求，除選擇合適的顯色劑外，控制顯色反應(yīng)條件也是非常重要的。因此，必須了解影響顯色反應(yīng)平衡及反應(yīng)速度的各種因素，并進(jìn)行嚴(yán)格控制，才能保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。1）顯色劑的用量

通常顯色反應(yīng)是可逆的，為了使待測(cè)組分完全定量地轉(zhuǎn)變?yōu)槲馕镔|(zhì)，顯色劑必須過(guò)量。過(guò)量的顯色劑可使反應(yīng)完全，但顯色劑用量過(guò)大，可能改變吸光物質(zhì)的組成。所以顯色劑的用量應(yīng)遵守過(guò)量、適量、定量。最適宜的顯色劑用量是通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的，即固定其它條件，改變顯色劑的用量，測(cè)吸光度，用A對(duì)顯色劑用量作圖，確定顯色劑的最適宜的用量。2）溶液的pH值

酸效應(yīng)比較重要，直接影響顯色劑的濃度和生成物的顏色。①酸度對(duì)顯色劑顏色的影響：必須選擇合適的pH值使其不干擾測(cè)定。如：pH＜6pH=7～10pH＞13黃橙紅紅二甲酚橙pH＜6pH＞6黃紅②酸度對(duì)顯色反應(yīng)的影響：不少有機(jī)顯色劑是有機(jī)弱酸或弱堿，溶液pH變化，顯色劑的存在型體會(huì)發(fā)生變化，顯色劑的顏色以及顯色反應(yīng)的完全程度都會(huì)受到影響。③酸度對(duì)金屬離子存在狀態(tài)的影響：很多金屬離子Fe3+、Al3+等容易水解，PH較高時(shí)，產(chǎn)生沉淀，影響測(cè)定?；腔畻钏幔⊿S）與Fe3+的絡(luò)合物pH=1.8-2.5pH=4-8pH=8-11.5pH＞12紫紅橙紅黃色沉淀FeSS+顯色反應(yīng)的最適宜酸度，應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。方法是：固定溶液中待測(cè)物、顯色劑的濃度，只改變酸度，測(cè)吸光度，以A對(duì)pH作圖，找出適宜的酸度范圍，如范圍較窄，則選用緩沖溶液。注意參比也要調(diào)pH值。3）顯色溫度顯色反應(yīng)一般在室溫下進(jìn)行，但有些反應(yīng)速度較慢，需在加熱條件下才能迅速完成。有些反應(yīng)產(chǎn)物在高溫下會(huì)分解而褪色。對(duì)需要加熱才能完成的顯色反應(yīng)，應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定適宜的顯色反應(yīng)溫度。需要注意的是：待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的溫度要盡量一致，有時(shí)要用恒溫水浴控溫。4）顯色時(shí)間

有的顯色反應(yīng)瞬間即可完成，即顯色后即可測(cè)定；有的顯色反應(yīng)進(jìn)行較慢，需經(jīng)過(guò)一定時(shí)間才能完全生成吸光物質(zhì)；有些情況下，吸光度得到一定值后又會(huì)慢慢降低。實(shí)際工作中，也應(yīng)通過(guò)測(cè)定樣品溶液在某波長(zhǎng)下的吸光度隨時(shí)間變化曲線，確定顯色反應(yīng)的最佳時(shí)間。5）有機(jī)溶劑①影響絡(luò)合物的解離度，如FeSCN在水中解離，加入丙酮后，解離度降低，顏色加深，提高了靈敏度。②影響反應(yīng)速度，如氯磺酚S測(cè)鈮Nb（V），水中顯色幾個(gè)小時(shí)，加入少量丙酮，顯色時(shí)間僅30min。6）干擾物的影響及消除方法影響：①干擾物本身有色或與顯色劑形成有色化合物，有吸收；②在顯色條件下，干擾物沉淀；③與待測(cè)離子生成更穩(wěn)定的化合物。消除方法：①掩蔽：丁二酮肟測(cè)定鎳時(shí)，用檸檬酸掩蔽消除鐵的干擾。②加入氧化劑或還原劑鉻天青測(cè)Al，F(xiàn)e3+有干擾；③控制酸度SS測(cè)Fe3+，Cu2+有干擾，PH=2.5；④分離干擾離子：沉淀、離子交換或溶劑萃取等方法。⑤選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤喝y(cè)定條件的選擇

測(cè)定條件包括測(cè)定波長(zhǎng)、吸光度讀數(shù)范圍和參比溶液。1.選擇測(cè)定波長(zhǎng)，一般選擇最大吸收波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，為什么？什么情況下不能采用最大吸收波長(zhǎng)作為測(cè)量波長(zhǎng)？545525測(cè)定不能采用最大吸收波長(zhǎng)2.吸光度讀數(shù)范圍選擇3.參比溶液在分光光度法中，常使用參比溶液或稱空白溶液，其作用是調(diào)節(jié)吸光度A=0，透光度T為100%，以便抵消吸收池和溶劑對(duì)入射光的影響、抵消試劑（包括顯色劑）或樣品基體所引起的干擾。正確選用空白溶液，對(duì)提高分析的準(zhǔn)確度非常重要。常用的參比有：溶劑空白當(dāng)溶液中只有待測(cè)組分有吸收，試劑（包括顯色劑）和樣品中的其他成分均無(wú)吸收時(shí)，可用溶劑作空白溶液，簡(jiǎn)稱溶劑空白。例如，測(cè)Mn2+時(shí)，用HIO4氧化Mn2+成MnO4-，試劑和樣品溶液均無(wú)色，可用蒸餾水作空白溶液。試劑空白

顯色劑或其它試劑有吸收，按顯色反應(yīng)相同