探討β-catenin蛋白敲除抗肺纖維化作用的細胞機制,病理學論文

探討β-catenin蛋白敲除抗肺纖維化作用的細胞機制,病理學論文肺纖維化是呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)展至晚期的共同病理改變,造成肺功能不可逆的損傷,嚴重危害人類健康。當前研究以為,肺纖維化的基本病理經過包括早期彌漫性肺泡炎及后期大量間質細胞增生,發(fā)生基質膠原的進行性積聚以致逐步取代正常的肺組織構造,嚴重影響肺的通氣和換氣功能。在增生的細胞中,除肺泡上皮細胞和成肌細胞等外,成纖維細胞的增殖及活化并分泌基質膠原是纖維化構成的重要機制。TGF-1被以為是誘導肺成纖維細胞活化的最重要的細胞因子,其作用的發(fā)揮與-catenin途徑高度相關。本研究通過觀察-catenin蛋白敲除對TGF-1誘導的肺成纖維細胞的增殖及活性的影響,討論-catenin蛋白敲除抗肺纖維化作用的細胞機制,為肺纖維化的治療提供新的思路。1、材料與方式方法1.1主要試劑及物品大鼠肺成纖維細胞(CCC-REPF-1),pcDNA3.0載體(Invitrogen),F-TrCP-Ecad載體(鄭國平教授惠贈),Lipofectamine2000(Invitrogen),TGF-1(PeproTech),抗E-cadherin,抗-SMA,抗Fn(SantaCruz),FITC標志的羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司),胎牛血清(中國杭州四季青),高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO),TRIzol總RNA提取試劑(武漢博士德生物工程有限公司),逆轉錄試劑盒(Promega),實時熒光定量試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司),-SMA引物、colⅠ引物、colⅢ引物、GAPDH引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)。1.2肺成纖維細胞培養(yǎng)、傳代及分組在體外培養(yǎng)的大鼠肺成纖維細胞(CCC-REPF-1),用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于5%的CO2,37℃人工培養(yǎng)箱中,細胞呈貼壁生長,進行傳代培養(yǎng)。細胞分組,分為正常細胞組、TGF-1刺激組、pcDNA3轉染組、F-TrCP-Ecad轉染組。1.3pcDNA3及F-TrCP-Ecad轉染CCC-REPF-1細胞提取及純化重組質粒DNA,測DNA濃度備用。取對數期細胞消化,調整細胞數為2105cells/L,接種12孔板中,觀察細胞生長至80%~90%時,棄培液,換無血清無雙抗培養(yǎng)基800L,準備轉染。100L無雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基中參加4ng質粒,混合后置5min,共6個EP管,3管為質粒pcDNA3,3管為質粒F-TrCP-Ecad,100L無雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基中參加4LLipofectamine2000混合后置5min,6個EP管,將上述復合物混合后置20min,棄12孔板6孔的培養(yǎng)基,用無雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基清洗2次,加無雙抗、胎牛血清的培養(yǎng)基800L,將上述復合物分別參加6個孔,前后晃置4~6h換正常培養(yǎng)基。轉染6h換新鮮培養(yǎng)基,各組分別參加TGF-1(5ng/mL),作用48h。1.4CCK-8法檢測肺成纖維細胞增殖將各組細胞調整細胞濃度至5000個/100L,以每孔100L接種于96孔板,每組復設8孔,每板每孔參加CCK-810L,5%CO2孵育箱內繼續(xù)孵育1h,分光光度計下測定450nm波長處OD值。1.5Western印跡檢測細胞中E-cadherin、-SMA、Fn的表示出取細胞用PBS洗滌后轉移到EP管,離心后棄上清,將收集到的細胞加細胞裂解液裂解1h后,離心30min,取上清,BCA蛋白質定量法測定蛋白濃度,取等量蛋白30L行SDS-PVDF凝膠電泳,轉膜至PVDF膜,條件4℃2~5h,5%脫脂牛奶封閉2h。在4℃下小鼠抗大鼠E鈣黏蛋白、-SMA、纖維連接蛋白單克隆抗體(稀釋為1∶200)與膜接觸孵育過夜,用洗膜緩沖液(TBST)在脫色搖床下洗膜5min5次,加羊抗小鼠IgG,室溫下孵育2h后,TBST洗膜,參加ECL在室溫下反響5min后成像,Taiphone掃描結果,采用GeneSnap/GeneTool軟件分析以GAPDH蛋白為內參定量分析E鈣黏蛋白、-SMA、纖維連接蛋白條帶相對灰度值。1.6總RNA抽提及實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反響(Real-timePCR)各組細胞每孔參加500LTRIzolReagent,按試劑盒講明提取總RNA及行RT-PCR檢測-SMA、colⅠ、colⅢ表示出,GAPDH為內參。GAPDH引物序列:上游引物5ˊ-GGTGCT-GAGTATGTCGTGGAGT-3ˊ下游引物5ˊ-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3,-SMA上游引物5ˊ-AGCCAGTCGCCATCAGGAAC-3ˊ下游引物5ˊ-GGGAGCATCATCCCAGCAA-3ˊ,colⅠ:上游引物5ˊ-GACATGTTCAGCTTTGTGTACCTC-3ˊ下游引物5ˊ-GGGACCCTTAGGCCATTGTGA-3ˊcolⅢ:上游引物5ˊ-TTTGGCACAGCAGTCCAATGTA-3ˊ下游引物5ˊ-GACAGATCCCGAGTTCGCAGA-3ˊ。PCR反應體系條件:95℃20s;95℃3s,60℃30s。40個循環(huán)。由隨機附帶軟件計算出Ct值和拷貝數。1.7統(tǒng)計學方式方法計量資料采用均數標準差表示,數據處理采用SPSS19.0軟件進行t檢驗或方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2、結果2.1肺成纖維細胞光鏡下觀察成纖維細胞呈梭型,有較長的突起,胞核呈卵圓形,位于細胞,成放射狀和柵欄狀排列。TGF-1刺激后,細胞體積明顯增大,胞突消失,細胞數量明顯增加,細胞間隙變小。F-TrCP-Ecad轉染組大部分細胞呈梭型,有較長的突起,細胞間有明顯間隙。2.2CCK-8法觀察各組肺成纖維細胞增殖與正常組比擬,TGF-1刺激組、pcDNA3轉染組其OD值明顯增高,但兩組比擬,無統(tǒng)計學差異;F-TrCP-Ecad轉染組OD值較TGF-1刺激組明顯減低(P0.01),與正常組比擬無統(tǒng)計學差異。見表1。2.3Western印跡法檢測各組細胞中-SMA、Fn、E-cadherin的表示出與正常組比擬,TGF-1刺激組、pcDNA3轉染組其-SMA、Fn蛋白表示出顯著升高,E-cadherin表示出顯著降低(P0.01),而兩組比擬無統(tǒng)計學差異;F-TrCP-Ecad轉染組較TGF-1刺激組-SMA、Fn蛋白表示出顯著降低,E-cadherin表示出顯著升高(P0.01),與正常組比擬無統(tǒng)計學差異。見表2。2.4熒光實時定量RT-PCR檢測-SMA、colⅠ、colⅢ表示出與正常組比擬,TGF-1刺激組、pcDNA3轉染組-catenin途徑-SMA,colⅠ,colⅢmRNA表示出增高(P0.01),而兩組比擬無統(tǒng)計學差異,F-TrCP-Ecad轉染組較TGF-1刺激組-SMA、colⅠ、colⅢ表示出降低(P0.01),與正常組比擬無統(tǒng)計學差異。見表3。3、討論肺成纖維細胞增殖與活性加強是肺纖維化發(fā)生的重要的致病經過,對其機制的研究并尋找新的治療靶點是當前研究的焦點。肺纖維化經過中在TGF-1刺激下使肺成纖維細胞不斷地增殖和轉型為肌成纖維細胞(myofibroblast,MB)。MB是一種特殊階段的FB,能夠大量分泌ECM,分泌能力是FB的4~5倍,大量表示出-SMA、Fn、I、III型膠原,加速纖維化進程。TGF-1是誘導肺成纖維細胞活化發(fā)生的最重要的生長因子,TGF-1發(fā)揮作用的途徑包括Smad、-catenin和非Smad通路,其-catenin途徑與疾病及纖維化構成的病理經過高度相關。Vuga,etal發(fā)現WNT5A基因途徑在IPF的肺成纖維細胞較正常肺成纖維細胞有顯著地調節(jié)意義,通過非經典的WNT/-catenin途徑WNT5A激活顯著地誘導肺成纖維細胞增殖同時抑制細胞凋亡。Chilosi等報道了在特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者受損支氣管基底細胞和損傷部位肺成纖維細胞中可見-catenin向細胞核內轉移、積聚,提示-catenin與肺纖維化及肺成纖維細胞活性的相關性,因而我們設想通過抑制-catenin功能可能對肺纖維化發(fā)揮治療作用。F-TrCP-Ecad質粒是Cong等設計的-catenin靶向降解質粒,只降解細胞質中的-catenin蛋白,而不毀壞細胞膜上的-catenin蛋白,進而減少其向細胞核內的轉移,降低其轉錄活性。本研究采用該載體轉染大鼠成纖維細胞,觀察阻斷-catenin途徑對肺成纖維細胞增殖及活性的影響。結果顯示:TGF-1刺激48h后,成纖維細胞體積明顯增大,胞突消失,細胞數量明顯增加,細胞間隙變小,F-TrCP-Ecad轉染組大部分細胞呈梭型,有較長的突起,細胞間有明顯間隙。CCK-8法檢測F-TrCP-Ecad轉染組肺成纖維細胞增殖較TGF-1刺激組明顯降低。F-TrCP-Ecad轉染組肺成纖維細胞間質細胞標志物-SMA、Fn蛋白表示出量明顯低于TGF-1刺激組,E-cadherin表示出量較TGF-1刺激組增高。F-TrCP-Ecad轉染組大鼠肺成纖維細胞-catenin途徑轉錄產物-SMA、colⅠ、colⅢ表示出明顯降低,證實-catenin蛋白敲除通過降解細胞質中的-catenin蛋白,減少