貝克曼流式細(xì)胞儀原理及軟件介紹

流式細(xì)胞儀

FLOWCYTOMETER原理及軟件介紹當(dāng)前1頁，總共44頁。BeckmanCoulter流式細(xì)胞儀發(fā)展史1947年WallaceCoulter發(fā)明了庫爾特原理，用于血細(xì)胞分析1953年推出了世界上第一臺流式細(xì)胞分析儀CoulterCounterModelA1972年推出世界上第一臺激光流式細(xì)胞儀EPICSII1975年研制出世界上第一臺帶計算機(jī)的流式細(xì)胞儀1997年推出世界上第一臺單激光四色數(shù)字化流式細(xì)胞儀EPICSXL/MCL2000年首先將高精度數(shù)字化顏色補(bǔ)償技術(shù)ADC（AdvancedDigitalCompensation）應(yīng)用于流式平臺，引領(lǐng)流式進(jìn)入全新的全矩陣補(bǔ)償、全自動補(bǔ)償和脫機(jī)補(bǔ)償時代2003年推出世界上第一臺單激光五色的流式細(xì)胞儀FC500/MCL，2005年升級為FC500/MPL2006年推出世界上第一臺具有EV參數(shù)同時進(jìn)行無成本絕對計數(shù)的多功能細(xì)胞分析系統(tǒng)QuantaSC，將流式細(xì)胞術(shù)與庫爾特原理完美結(jié)合，2007年推出MPL進(jìn)樣系統(tǒng)2007年收購Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成為高端流式市場的領(lǐng)導(dǎo)者2009年，推出世界是第一臺三激光十色的分析型流式細(xì)胞儀Gallios/Navios當(dāng)前2頁，總共44頁。EPICSXL-ADC

QUANTASCCytomicsFC500BeckmanCoulterCelllabFamilyMoFloXDPGallios/NaviosCyanADP當(dāng)前3頁，總共44頁。FC500硬件當(dāng)前4頁，總共44頁。Whatisflowcytometry?流式細(xì)胞術(shù)是單個細(xì)胞/顆粒流過檢測裝置過程中，檢測到的物理和/或化學(xué)的特性。HowardShapiro,PracticalFlowCytometry,3rdEdition當(dāng)前5頁，總共44頁。分類分析型：只能分析用，液流進(jìn)入廢液筒分選型：回收目標(biāo)細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。要求管道絕對無菌。當(dāng)前6頁，總共44頁?；驹砹髀罚ㄒ毫飨到y(tǒng)）流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細(xì)胞懸液5*105~1*106個/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光源濾片光電倍增管PMTHV電路（電路系統(tǒng)）放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換分析系統(tǒng)：計算機(jī)當(dāng)前7頁，總共44頁。液流系統(tǒng)當(dāng)前8頁，總共44頁。流路構(gòu)造當(dāng)前9頁，總共44頁。流路單細(xì)胞懸液大多數(shù)儀器是在50-300μm大小的孔徑中,將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中這一過程,成為流體動力學(xué)聚焦當(dāng)前10頁，總共44頁。FLOWCELLInjector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluid當(dāng)前11頁，總共44頁。光路系統(tǒng)當(dāng)前12頁，總共44頁。光路構(gòu)造當(dāng)前13頁，總共44頁。光路光源檢測信號散射光信號

FS:前向角散射光

SS:側(cè)向角散射光(90度散射光)

熒光信號 熒光染料 光學(xué)濾片當(dāng)前14頁，總共44頁。

光路光源 與通過的細(xì)胞聚焦在同一點(diǎn)上激光

空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,空冷/水冷EnterpriseII水冷Innova300系列 Innova70系列當(dāng)前15頁，總共44頁。常用激光器及其通道分配表當(dāng)前16頁，總共44頁。檢測信號當(dāng)前17頁，總共44頁。散射光信號—前向散射光(FS)FS----Forward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測器,為前向散射光檢測器

FS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關(guān)FS用于檢測細(xì)胞或其他粒子的表面屬性 如:大小當(dāng)前18頁，總共44頁。FALSSensorLaser前向散射光

當(dāng)前19頁，總共44頁。前向散射光當(dāng)前20頁，總共44頁。散射光信號–側(cè)向散射光SS-Side

(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器,也稱為90度散射光檢測器SS用于檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 如:胞漿內(nèi)顆粒多少,核質(zhì)比當(dāng)前21頁，總共44頁。FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光當(dāng)前22頁，總共44頁。側(cè)向散射光當(dāng)前23頁，總共44頁。90DegreeScatter0

200

400

600

8001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale當(dāng)前24頁，總共44頁。光路-熒光信號每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長,并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式細(xì)胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長.

利用各種不同波長的光學(xué)濾片來收集(檢測)這些光學(xué)信號當(dāng)前25頁，總共44頁。熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)當(dāng)前26頁，總共44頁。常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670當(dāng)前27頁，總共44頁。5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC7當(dāng)前28頁，總共44頁。熒光染料比較(平均熒光強(qiáng)度)

Q-Prep/ImmunoPrep試劑系統(tǒng)PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC當(dāng)前29頁，總共44頁。FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)當(dāng)前30頁，總共44頁。光路-濾片特性

長通濾片

–

允許長于設(shè)定波長的光通過

短通濾片–

允許短于設(shè)定波長的光通過

帶通濾片–

允許一定帶寬的波長通過當(dāng)前31頁，總共44頁。光路-濾片特性當(dāng)以45o

角放置濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光

這種方式的濾片稱為二向色性濾片(dichroicfilter)

當(dāng)前32頁，總共44頁。濾片帶通濾片BANDPASS(BP)只允許某些波長的光通過二向色性濾片DICHROICFILTER一定波長以上通過，該波長以下折射630nmBandPassFilterTransmittedLightWhiteLightSource620-640nmLightDichroicFilter/Mirrorat45degReflectedlightTransmittedLightLightSource當(dāng)前33頁，總共44頁。當(dāng)前34頁，總共44頁。電路系統(tǒng)當(dāng)前35頁，總共44頁。Optics-DetectorsPhotomultipliertube(PMT)

將光學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號

當(dāng)前36頁，總共44頁。不同的脈沖信號被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程

當(dāng)前37頁，總共44頁。當(dāng)前38頁，總共44頁。SingleParameterH