麻疹病毒的感染性克隆研究,病毒學(xué)論文

麻疹病毒的感染性克隆研究,病毒學(xué)論文麻疹病毒屬從屬于副黏病毒科副黏病毒亞科，共6個病毒成員，包括犬瘟熱病毒〔Caninedistem-pervirus,CDV〕、麻疹病毒〔Morbillivirus〕、海豹瘟病毒〔Phocinedistempervirus,PDV〕、牛瘟病毒〔Rinderpestvirus,RPV〕、鯨類動物麻疹病毒〔Ceta-ceanmorbillivirus,CeMV〕和小反芻獸疫病毒〔Pes-te-des-petits-ruminantsvirus,PPRV〕，核酸序列為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA,基因長度為16kb左右，基因組含有6個基因，從3端到5端依次為N-P-M-F-H-L,依次編碼核衣殼蛋白〔nucleocapsidprotein,N〕、磷蛋白〔phosphoprotein,P〕、基質(zhì)膜蛋白〔ma-trixprotein,M〕、融合蛋白〔fusionprotein,F〕、血凝蛋白〔hemagglutinin,H〕和大蛋白〔largevirus-spec-ifiedRNApolymeraseprotein,L〕，以及非構(gòu)造蛋白V和C.麻疹病毒對人和動物危害極大，當(dāng)前牛瘟病毒已被成功凈化，其他病毒的凈化工作還有待進(jìn)一步加強(qiáng)，解決這一難題均可通過構(gòu)建麻疹病毒屬病毒全長感染性克隆來實(shí)現(xiàn)。1反向遺傳操作系統(tǒng)文獻(xiàn)資料顯示，當(dāng)前應(yīng)用于不分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)主要有T7RNA聚合酶和RNA聚合酶Ⅱ反向遺傳操作系統(tǒng)[1].1.1基于T7RNA聚合酶的反向遺傳操作系統(tǒng)T7RNA聚合酶〔T7RNApolymerase〕是一種由T7噬菌體編碼RNA聚合酶，長度為883個氨基酸，分子質(zhì)量約99ku,專門催化53方向的RNA合成經(jīng)過。啟動子T7RNA聚合酶專一性強(qiáng)，即只會轉(zhuǎn)錄T7啟動子下游的DNA.轉(zhuǎn)錄一旦開場，聚合酶就會沿著模板方向不斷向前移動合成RNA,直至碰到終止子〔terminator〕序列為止，不再向新合成的RNA鏈繼續(xù)添加核苷酸，進(jìn)而新合成的RNA鏈便從DNA模板解離[2].基于T7RNA酶其轉(zhuǎn)錄具有嚴(yán)格的合成高效性和轉(zhuǎn)錄特異性的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于麻疹病毒屬病毒的全長cDNA轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建[3].T7RNA聚合酶細(xì)胞系的應(yīng)用極大地提高了病毒的拯救效率，借助此細(xì)胞系轉(zhuǎn)染含病毒基因組cDNA克隆和輔助表示出質(zhì)粒就能夠?qū)崿F(xiàn)病毒的拯救[4].將含有T7RNA聚合酶的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過使用新霉素加壓挑選，獲得一株穩(wěn)定表示出T7RNA聚合酶的細(xì)胞BSRT7/5,該細(xì)胞系已被廣泛應(yīng)用[5].也有學(xué)者將T7RNA聚合酶表示出在豬腎細(xì)胞，完成了豬瘟病毒的拯救。1.2基于RNA聚合酶Ⅱ的反向遺傳操作系統(tǒng)T7RNA聚合酶系統(tǒng)需要預(yù)先感染攜帶T7RNA聚合酶的重組痘病毒或轉(zhuǎn)染能表示出T7RNA聚合酶的特定細(xì)胞系，操作經(jīng)過相對繁瑣，且易造成外源病毒污染。為解決上述難題，國內(nèi)外學(xué)者不斷嘗試建立一種僅借助于細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶的拯救系統(tǒng)。RNA聚合酶Ⅱ位于細(xì)胞核的核質(zhì)內(nèi)，蛋白分子質(zhì)量為550ku,由12個亞基組成，負(fù)責(zé)合成mR-NA的前體。當(dāng)前已成為應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)之一，商品化的真核轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建多該轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。最常見的RNA聚合酶Ⅱ啟動子為猿病毒40啟動子和人的巨細(xì)胞病毒啟動子。RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于3末端被切斷，經(jīng)腺苷酸化后合成RNA,無明顯的RNA轉(zhuǎn)錄終止信號[6].諸多學(xué)者用含人、犬、棉鼠和羊等SLAM受體的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9、CHO、Vero、MDCK、CRFK、BHK-21和CV1等細(xì)胞，通過加壓挑選，獲得穩(wěn)定表示出SLAM的細(xì)胞系，該細(xì)胞系在分離病毒和反向遺傳等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[7-8].2牛瘟病毒的感染性克隆牛瘟雖已被消滅，但牛瘟病毒感染性克隆的研究在很大程度上推動了其他病毒的相關(guān)研究，為其他病毒的凈化創(chuàng)造條件。BaronMD等[9]克隆出具有精到準(zhǔn)確末端的牛瘟病毒的全基因組序列，并通過可表示出T7RNA聚合酶的重組痘病毒，成功拯救RBOK疫苗株。DasSC等[10]通過制備嵌合的RPV〔即PPRV的H或F基因取代RPVH或F基因〕，結(jié)果表示清楚，當(dāng)僅取代1個基因無法成功拯救病毒，同時取代2個基因，才能夠成功拯救嵌合病毒，講明F和H基因同時存在方可成功拯救牛瘟病毒。ParidaS等[11]成功拯救出一種嵌合牛瘟病毒系統(tǒng)，結(jié)果顯示，該嵌合體病毒在細(xì)胞培養(yǎng)維持高效率的復(fù)制，使用該嵌合疫苗接種的牛無不良反響。Ban-yardAC等[12]于2018年成功拯救在RPV全基因組的P基因下游和M基因上游之間具有獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單元的EGFP基因的RPV,使用共聚焦顯微鏡即可完成RPV復(fù)制的檢測。3犬瘟熱病毒的感染性克隆當(dāng)前已成功構(gòu)建Onderstepoort、A75/17、5804P、OS和neurovirulentSnyderHill等病毒株的感染性克隆[13].GassenU等[14]利用T7RNA聚合酶系統(tǒng)成功拯救CDVOnderstepoort疫苗株，采用點(diǎn)突變技術(shù)于L基因的編碼區(qū)突變2個堿基，實(shí)現(xiàn)拯救病毒和親本病毒的區(qū)分。PlattetP等[15]也構(gòu)建出CDVA75/17株的感染性克隆，并將GFP成功插入CDV基因組，拯救出能夠表示出GFP的重組病毒。vonMesslingV等[16]在研究中對重組病毒的細(xì)胞嗜性、融合特性和生長特性與親本毒株比擬后發(fā)現(xiàn)，影響CDV細(xì)胞嗜性和細(xì)胞致病性的主要決定因子不是病毒骨架。也有學(xué)者以馴化致弱后的犬瘟熱病毒小熊貓株作為模板，成功拯救出CDV小熊貓株。近年來，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量CDV致病機(jī)理領(lǐng)域的研究工作，LudlowM等[17]在構(gòu)建CDVSH株感染性克隆的基礎(chǔ)上，采用反向遺傳學(xué)技術(shù)將EGFP或者紅色熒光蛋白插入到CDV基因組中，用拯救的病毒感染雪貂，通過檢測報(bào)告基因的表示出，表示清楚CDV感染動物以后能迅速突破血腦屏障進(jìn)入腦脊液，并擴(kuò)散到蛛網(wǎng)膜下腔，引起動物發(fā)生急性病毒性腦膜炎，進(jìn)一步促進(jìn)了患病動物體內(nèi)病毒的傳播途徑的敏感性病理評估，成功構(gòu)建出研究CDV傳播機(jī)理和急性病毒性腦膜炎發(fā)病機(jī)理的新型模型。也有研究將序列比對，在CDV基因組M和F基因之間存在的非翻譯區(qū)〔UTR〕具有較高的變異性，利用反向遺傳技術(shù)將CDV不同毒株之間的M~F區(qū)段進(jìn)行互相交換，發(fā)現(xiàn)這種改變并不影響病毒的毒力或者表型，證明該區(qū)段在功能上能夠互換。RouxelRN等[18]將CDV的M、F、H與MV的反向遺傳載體構(gòu)建嵌合疫苗，由此產(chǎn)生的病毒沒有引起雪貂疾病或免疫抑制，并具有一定的免疫保衛(wèi)作用。4小反芻獸疫病毒的感染性克隆小反芻獸疫病毒主要感染小反芻動物，表現(xiàn)為發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎，在世界范圍內(nèi)廣泛流行。國外學(xué)者成功克隆PPRV的全基因序列，利用精到準(zhǔn)確的3和5末端構(gòu)建出的Tu/00株P(guān)PRV的微型基因組，并針對感染性克隆的啟動子開展研究，結(jié)果表示清楚，有效的微型基因組須包括順式元件、反基因組的啟動子和3個輔助性質(zhì)?！布碞、P和L〕。將全長分4段進(jìn)行擴(kuò)增，將基因內(nèi)部酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接，并將報(bào)告基因eGFP插入P基因與M基因之間[19].國內(nèi)有學(xué)者將外源表位與N蛋白的羧基端融合，替代原始的N蛋白的輔助質(zhì)粒，結(jié)果證明外源表位幾乎不影響病毒的拯救，表示清楚融合外源表位后對N蛋白的功能影響較小[20].在這里基礎(chǔ)之上，YinC等[21]利用已構(gòu)建的PPRV/N75/1株反向遺傳操作系統(tǒng)，構(gòu)建了表示出亞洲1型FMDV-VP1蛋白的重組病毒，接種山羊和牛均可誘導(dǎo)產(chǎn)生PPRV和FMDV中和抗體，結(jié)果表示清楚，針對亞洲1型FMDV強(qiáng)毒的攻擊的具有免疫保衛(wèi)作用，講明PPRV/N75/1株作為活載體疫苗具備技術(shù)可行性。YunusM等[22]從病毒感染細(xì)胞中提取和純化的核糖核蛋白復(fù)合物、N蛋白包裹的RNA模板和在昆蟲細(xì)胞中表示出的重組聚合酶復(fù)合物，并將這些成分組合在一起建立PPRV的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在體外持續(xù)轉(zhuǎn)錄所有蛋白的mRNA,表現(xiàn)出梯度轉(zhuǎn)錄特性。Mu-nirajuM等[23]利用體外轉(zhuǎn)錄的方式方法成功拯救Mo-rocco/2008.WangZ等[24]于西藏山羊體內(nèi)初次檢測并分離得到病毒，利用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)成功拯救了PPRVTibet/Bharal/2008株。5結(jié)束語反向遺傳學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，對于病毒而言，借助分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)，研究范圍不斷地拓展和延伸。麻疹病毒屬成員的致病機(jī)理的研究相對復(fù)雜，反向遺傳操作技術(shù)成為其致病機(jī)理研究的輔助