幾種金銀花的高效液相色譜法鑒別與系統(tǒng)聚類分析

幾種金銀花的高效液相色譜法鑒別與系統(tǒng)聚類分析作者：趙惠茹，王銳平，路平，魏彩霞，王燕【關(guān)鍵詞】金銀花；高效液相色譜；系統(tǒng)聚類分析摘要：目的鑒別17種金銀花的質(zhì)量。方法采用高效液相色譜法對(duì)樣品進(jìn)行分析，獲得反映樣品整體化學(xué)特征的數(shù)據(jù)，利用聚類分析進(jìn)行分類。結(jié)果在選定的色譜條件下，建立了穩(wěn)定可控的藥材高效液相色譜圖，系統(tǒng)聚類法可將樣品有效地分類。結(jié)論該方法鑒別金銀花是可行的，能為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供有用的信息。關(guān)鍵詞：金銀花；高效液相色譜；系統(tǒng)聚類分析金銀花始載于《名醫(yī)別錄》，歷代本草均有記載。20XX年版《中國(guó)藥典》收載的種類為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花［1］。其作為常用中藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效。在臨床上廣泛用于急性熱病及外科感染性疾病。該藥材植物來(lái)源復(fù)雜，在全國(guó)幾乎都有分布。據(jù)文獻(xiàn)［2,3］報(bào)道，目前市售金銀花商品十分混亂，有47余種植物的花蕾在各地均被當(dāng)作金銀花入藥，如不加以區(qū)別，便會(huì)影響臨床療效。針對(duì)這一客觀存在的問(wèn)題，本文對(duì)不同來(lái)源的17種金銀花樣品的化學(xué)成分進(jìn)行了HPLC分析，由此獲得金銀花的化學(xué)信息，應(yīng)用系統(tǒng)聚類分析的方法進(jìn)行分類，為制定綜合評(píng)價(jià)金銀花質(zhì)量的新方法進(jìn)行了探索。近年來(lái)，系統(tǒng)聚類方法［4，5］越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥材鑒別與分析領(lǐng)域，這是利用數(shù)學(xué)手段對(duì)一群事物按其“屬性”進(jìn)行分類的方法。它作為一種特定的方法，從數(shù)據(jù)分析的角度給出了一個(gè)更準(zhǔn)確、細(xì)致的分類工具。本文即用此法對(duì)金銀花進(jìn)行了研究，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為中藥金銀花的正、偽品鑒別分析提供了一種新的方法。儀器與材料儀器Agilent1100高效液相色譜儀（脫氣機(jī)、四元泵、紫外檢測(cè)器、柱溫箱、HPChemstations工作站）；KQ-50型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器廠）。試藥綠原酸對(duì)照品和金銀花對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所），乙腈為色譜純，磷酸為分析純，三蒸水（自制）。金銀花樣品分別購(gòu)自各地藥材公司，經(jīng)本院天然藥物教研室鑒定，其來(lái)源及編號(hào)見表1。方法色譜條件YGWC18(250mm-×，5μm)；流動(dòng)相：A液乙腈，B液%磷酸水溶液，梯度洗脫（0~12min：乙腈∶5%~15%，12~20min：乙腈∶15%~25%，20~30min：乙腈∶25%~30%，30~40min：乙腈∶30%~5%）；流速：?min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：25℃。表1樣本來(lái)源與編號(hào)（略）綠原酸對(duì)照品溶液的制備精密稱取綠原酸對(duì)照品，用乙腈%磷酸水溶液（5∶95）定容至10ml，配成?ml-1的原液備用。金銀花藥材對(duì)照品的制備精密稱取金銀花藥材對(duì)照品 100mg，用乙腈%磷酸水溶液（5∶95）定容至10ml，超聲提取30min后過(guò)濾，濾液作為藥材對(duì)照品溶液備用。供試品溶液的制備將以上各金銀花樣品干燥后粉碎， 過(guò)60目篩，精密稱取各樣品粉末100mg，用乙腈%磷酸水溶液（5∶95）定容至10ml，超聲提取30min后過(guò)濾，濾液作為樣品溶液備用。方法學(xué)考察穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一份供試品溶液（金銀花藥材2），分別在0，2，4，8，16，24h檢測(cè)，其相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3%，主要峰面積RSD小于5%，說(shuō)明溶液至少在24h內(nèi)穩(wěn)定。精密度實(shí)驗(yàn)取同一份供試品溶液（金銀花藥材2），連續(xù)進(jìn)樣5次，考察色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和主要峰面積比值的一致性。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和主要峰面積比值的RSD均小于3%，說(shuō)明精密度良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取金銀花藥材2供試品5份，同法檢測(cè)，考察色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和主要峰面積比值的一致性。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和主要峰面積比值的RSD均小于2%，說(shuō)明分析方法重復(fù)性符合要求。測(cè)定法取金銀花藥材對(duì)照品溶液和供試品溶液按照項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得到金銀花對(duì)照藥材的高效液相色譜圖（見圖1）和17批樣品的高效液相色譜圖。同時(shí)用綠原酸對(duì)照品溶液同體積進(jìn)樣分析，確定綠原酸的出峰時(shí)間。以金銀花對(duì)照藥材中各色譜峰的總面積為分母，樣品中各個(gè)色譜峰面積為分子，計(jì)算該色譜峰的相對(duì)峰面積值。結(jié)果見表2。5-綠原酸 :s:// 論文在線圖1金銀花藥材對(duì)照品的高效液相色譜圖（略）表2樣本中各峰的相對(duì)峰面積（略）結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)獲得的 HPLC數(shù)量化特征進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖2。圖217種金銀花的系統(tǒng)聚類分析（略）討論按本實(shí)驗(yàn)擬定的方法，測(cè)定了17批金銀花樣品的高效液相色譜圖，選擇其中峰面積最大的8個(gè)峰排列成表，并結(jié)合各色譜峰在17批樣品中出現(xiàn)的頻率，共標(biāo)出12個(gè)共有峰，總共有峰峰面積含量在%~%之間，各批樣品間主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間亦較穩(wěn)定，峰值比例較典型。以12個(gè)共有峰作為聚類分析的指標(biāo)，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)良好，因此，可初步擬定為金銀花乙腈提取物成分的指標(biāo)成分群。本實(shí)驗(yàn)比較了等度洗脫和梯度洗脫對(duì)金銀花高效液相色譜圖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)等度洗脫時(shí)，改變流動(dòng)相的組成或比例只能得到較少的色譜峰，而改用梯度洗脫，則可得到金銀花藥材所含組分的大量信息，樣品中不同極性的組分均獲得了相對(duì)穩(wěn)定的峰形和峰面積，且基線較平穩(wěn)，保留時(shí)間適宜，分離效果較好。由聚類分析結(jié)果可以看出，樣品1~10，16，17號(hào)聚為一類，它們分別來(lái)源于忍冬和山銀花，樣品12，14，15號(hào)與樣品11，13號(hào)首先分別各自聚為一類，然后再共聚為一大類，它們分別為金銀花的各地常見代用品?？梢姡诒疚牡纳V實(shí)驗(yàn)和聚類分析參數(shù)條件下，金銀花正品與各地代用品的分類鑒別效果比較明顯。但是8種正品金銀花之間的鑒別效果并不甚理想，且缺乏量化指標(biāo)，其原因是否與產(chǎn)地和生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，尚待實(shí)驗(yàn)研究。目前，金銀花的鑒別和分類很大程度上還依賴于經(jīng)驗(yàn)和表觀分析，缺乏從分析數(shù)據(jù)中獲取依據(jù)的方法。本實(shí)驗(yàn)基于金銀花高效液相色譜圖整體面貌的共性特征，選取了包括綠原酸在內(nèi)的12個(gè)特征峰，獲得了相對(duì)峰面積值，用系統(tǒng)聚類分析的方法對(duì)金銀花的質(zhì)量做出了較全面、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)，具有數(shù)學(xué)概念簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)處理比較簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，能有效地將正品與代用品分開。參考文獻(xiàn)：［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，Ⅰ部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,20XX：152.［2］石鉞,石任兵,陸蘊(yùn)如.我國(guó)藥用金銀花資源及藥理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志,1999,34(11):724.［3］于生蘭,張龍,孫玲.金銀花的研究進(jìn)展［J］.