生物樣品多氯聯(lián)苯分析方法分享

水生態(tài)毒理研究組 環(huán)境樣品中污染物分析方法規(guī)范 1沉積物中多氯聯(lián)苯類化合物分析規(guī)范目標化合物20世紀70年代中期，美國在“清潔水法”中規(guī)定了129種優(yōu)先污染物，其中包括 6類PCBAroclors，屬于多氯聯(lián)苯類化合物，本論文中研究的主要多氯聯(lián)苯目標化合物則選擇其中有代表性的 12種同族物，它們分別是： PCB18、28、29、44、52、101、118、138、149、153、180、194（數(shù)字均為IUPAC編號）。試劑、器皿和儀器試劑二氯甲烷(Dichloromethane)，農(nóng)殘級（美國FisherScientific公司）；甲醇（Methanol），HPLC級（美國FisherScientific公司）；正己烷（n-Hexane），農(nóng)殘級（美國FisherScientific公司）；Florisil（即佛羅里達硅土，120目），農(nóng)殘級（美國SIGMA）；中性氧化鋁（50－200目），（美國ACROSORGANICS）；無水硫酸鈉，優(yōu)級純，經(jīng)450℃焙燒12h后置于密封廣口瓶中保存?zhèn)溆茫欢嗦嚷?lián)苯標準物質(zhì)：12種多氯聯(lián)苯同族物組成的混合標樣，購自美國 SupelcoCo.；內(nèi)標化合物（I.S.）：五氯硝基苯（PCNB），購自美國SupelcoCo；回收率指示物(S.S.)：2，4，5，6-四氯間二甲苯（TMX）和十氯聯(lián)苯（PCB209）購自美國SupelcoCo；(SupelcoCo.的材料由北京康林公司購買，業(yè)務(wù)電話010-64926155)。剪刀、濾紙、鑷子及藥匙（硅膠柱凈化所用） ：以二氯甲烷超聲清洗 15min兩次、正己烷超聲清洗 15min一次；Florisil在400±2?C活化2（hactivate）；待冷卻至室溫時，稱重后裝入大口錐形瓶（250或500mL），加入其重量11%的蒸餾水去活性（deactivate），添加過程中應(yīng)用滴管逐Page1/6水生態(tài)毒理研究組 環(huán)境樣品中污染物分析方法規(guī)范 1滴加入，邊加邊用力振搖以防止結(jié)塊，并超聲振蕩 30min；放置過夜，平衡后加入正己烷浸沒其表面?zhèn)溆茫ㄒ话阋残璺胖眠^夜） ，此時的Forisil呈現(xiàn)淺灰色。2.2. 儀器超聲波清洗儀(KQ－250D型數(shù)控超聲波清洗器)恒溫水浴鍋（中國科工衛(wèi)儀器儀表公司）電子天平(精確到0.0001g，SartoriusAG.Co.,BS1005)冷凍干燥儀(FD-1冷凍干燥機，北京博醫(yī)康公司）旋轉(zhuǎn)旋蒸儀(Buchi,Vac?500/rotavaporR-200/HeatingbathB-490,Germany)氮吹儀(數(shù)控氮吹儀，KL512/5093,康林,北京)蛇形索氏提取器(北京玻璃儀器公司，250ml)63(GC-μECD)(AgilentTechnologies，氣相色譜儀：HP6890-Ni微池電子捕獲檢測器美國)，使用AgilentChemStationforGCSystems分析處理數(shù)據(jù)；毛細色譜柱：HP-5石英毛細管色譜柱：30m0.32mmID0.25m液膜厚不銹鋼泥抓斗100級超凈工作室；高純氮氣便攜式保溫箱不銹鋼采樣小盒瑪瑙研缽及研杵玻璃儀器及其它用品專用玻儀：雞心瓶、K.D濃縮器、8ml定量樣品瓶，250ml分液漏斗，層析柱（長Page2/6水生態(tài)毒理研究組 環(huán)境樣品中污染物分析方法規(guī)范 135cm，內(nèi)徑1cm，帶活塞）、GC自動進樣的樣品瓶。常規(guī)玻儀及其他用品：100ml、50ml、10ml量筒；200ml、100ml、50ml燒杯；500ml、50ml試劑瓶；膠頭滴管、玻璃漏斗、玻璃棒； 100ml、50ml三角瓶（帶塞）；坩堝、藥匙、5ml移液管、微量進樣器、乳膠手套、布手套等。所用玻璃儀器均以 10％的稀硝酸浸泡過夜，再以重鉻酸鉀洗液潤洗浸泡 20min以上，分別用自來水、蒸餾水沖洗干凈，在烘箱中 110℃烘干；GC自動進樣的樣品瓶、標準樣品瓶、層析柱必須用鉻酸洗液浸泡一段時間后再認真沖洗干凈烘干，并在 400?C高溫烘烤2小時以上。樣品采集與保存現(xiàn)場捕撈生物樣品(魚等)放入溶劑淋洗過的不銹鋼容器，并注明采樣時間、采樣地點、樣品編號、樣品名稱、采樣人姓名等。立即冷凍，放入便攜式保溫箱中帶回實驗室。樣品運回實驗室后保存于冰箱（4℃）中，密封保存(注意避光)，在存放樣品時，應(yīng)盡量注意存放在沒有有機氣體干擾的區(qū)域，以免交叉污染。所采樣品在7天內(nèi)前處理完畢，一個月內(nèi)分析完畢。樣品制備4.1. 制備冷凍的生物樣品在室溫下融化后，用干凈的不銹鋼小勺攪拌均勻，然后在冷凍干燥儀上冷凍干燥，干燥后的樣品經(jīng)研磨(研磨后過60目不銹鋼篩)，準確稱取25.00g沉積物樣品，加入回收率指示物 TMX和PCB209(加入濃度根據(jù)當?shù)匚廴境潭却_定，原則是與樣品中目標污染物濃度相接近 )，在平衡24小時后，用濾紙包裹(包裹要嚴實，避免泄漏)。Page3/6水生態(tài)毒理研究組 環(huán)境樣品中污染物分析方法規(guī)范 1冷凍的生物樣品在室溫下融化后，用干凈的不銹鋼小勺攪拌均勻，然后在冷凍干燥儀上冷凍干燥，干燥后的樣品經(jīng)研磨 (研磨后過60目不銹鋼篩)，準確稱取5.00g沉積物樣品，加入回收率指示物 TMX和PCB209(加入濃度根據(jù)當?shù)匚廴境潭却_定，原則是與樣品中目標污染物濃度相接近 )，用濾紙包裹(包裹要嚴實，避免泄漏)。4.2. 提取將包有樣品的生物樣品放入蛇形索氏提取器中，添加 200ml二氯甲烷，在平底燒瓶中加入10片左右底銅片(1cm2)，放在水浴鍋中，水浴鍋溫度控制在57-590C，回流速度控制在 5-6次/h，連續(xù)抽提 72hrs。在提取結(jié)束后，將蛇形管中的溶劑盡量完整的導(dǎo)入平底燒瓶中，作好編號。將包有樣品的生物樣品放入蛇形索氏提取器中，添加 200ml 丙酮：正己烷 1：1試劑，在索氏提取器中加入 10片左右底銅片(1cm2)，放在水浴鍋中，水浴鍋溫度控制在57-590C，連續(xù)抽提 24hrs。在提取結(jié)束后，將蛇形管中的溶劑盡量完整的導(dǎo)入平底燒瓶中，作好編號。5.樣品凈化5.1.脫脂將提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(旋轉(zhuǎn)過程中注意蒸發(fā)速度，溫度390C,真空度500)，濃縮至約5ml，使用15ml正己烷定量轉(zhuǎn)移到50ml雞心瓶中，使用10ml濃硫酸(分三次)脫脂（濃硫酸在底層，使用滴管將上清夜轉(zhuǎn)移到另一雞心瓶中） ；繼續(xù)濃縮至1ml左右，加入10ml正已烷，再次濃縮至 1ml，完成溶劑替換。將提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上 (旋轉(zhuǎn)過程中注意蒸發(fā)速度，溫度 390C,真空度500)，濃縮至約20ml，使用5ml濃硫酸脫脂（濃硫酸在底層，使用滴管將上清夜轉(zhuǎn)移到Page4/6水生態(tài)毒理研究組 環(huán)境樣品中污染物分析方法規(guī)范 1另一個比色管中，再使用 5ml濃硫酸脫脂，上清液轉(zhuǎn)移至另一雞心瓶（ 250ml）中,；繼續(xù)濃縮至1ml左右，完成溶劑替換。上樣時直接上樣，再加 2-3ml溶劑潤洗，潤洗液也上柱。5.2.凈化采用Florisil層析柱凈化。采用濕法裝柱法，在干凈的50cm長內(nèi)徑為10mm的層析柱上用記號筆在19cm處做上記號，取一個干凈漏斗置于層析管頂端。先用10mL正己烷淋洗層析管，從下端排出至液面剛好浸沒石英砂層，此淋洗液廢棄。關(guān)上開關(guān)后，再加入20mL正己烷，用濕法裝柱，用藥匙將10gFlorisil從頂端漏斗加入（Florisil層的上界面在19cm的記號線位置）。注意在裝柱過程中，要不斷地加入正己烷以免其黏附在管壁上，并保持正己烷以適當?shù)牧魉俨粩嗟亓鞒?，且保證正己烷液面始終高于柱界面（即柱子不能斷裂）；同時不斷地用吸耳球輕輕敲打滴定管，使Florisil層緊密。最后以同樣方法再在Florisil層上裝入1cm的無水硫酸鈉，用于樣品脫水。調(diào)節(jié)正己烷液面，使其正好處于無水硫酸鈉層面之上，關(guān)閉開關(guān)備用（注意此時管壁上不得粘有固體顆粒，否則需用正己烷沖洗干凈再調(diào)節(jié)液面）。整個裝柱過程中，正己烷可回收循環(huán)使用。將1mL待凈化濃縮樣品用滴管移入凈化柱中，浸泡5min以上，保證樣品與凈化柱充分接觸交換。洗脫：以15mL正己烷分三次洗滌盛有二氯甲烷樣品的K-D濃縮器，均用滴管移入凈化柱中，然后以90滴/min左右的流速流出，并繼續(xù)添加正己烷，使洗脫溶劑總體積為100mL，直至流干，洗脫液用250mL平底燒瓶收集。5.3.待測樣制備正己烷洗脫液繼續(xù)濃縮至2ml，加入內(nèi)標(PCNB)，用柔和的氮氣吹蒸定容至0.2Page5/6水生態(tài)毒理研究組 環(huán)境樣品中污染物分析方法規(guī)范 1ml，作為儀器分析待測樣。待測液定容后轉(zhuǎn)移至 GC自動進樣用的樣品瓶中，用壓蓋器密封后存放于冰箱中待測。凈化采用Florisil層析柱凈化。采用濕法裝柱法，在干凈的 50cm長內(nèi)徑為10.5mm的層析柱上用記號筆在 17cm處做上記號，取一個干凈漏斗置于層析管頂端。先用10mL正己烷淋洗層析管，從下端排出至液面剛好浸沒石英砂層，此淋洗液廢棄。關(guān)上開關(guān)后，用濕法裝柱，用藥匙將 10gFlorisil從頂端漏斗加入（Florisil層的上界面在17cm的記號線位置）。注意在裝柱過程中，要不斷地加入正己烷以免其黏附在管壁上，并保持正己烷以適當?shù)牧魉俨粩嗟亓鞒觯冶ＷC正己烷液面始終高于柱界面（即柱子不能斷裂）；同時不斷地用吸耳球輕輕敲打滴定管，使 Florisil層緊密。最后以同樣方法再在 Florisil層上裝入1cm的無水硫酸鈉，用于樣品脫水。調(diào)節(jié)正己烷液面，使其正好處于無水硫酸鈉層面之上，關(guān)閉開關(guān)備用（注意此時管壁上不得粘有固體顆粒，否則需用正己烷沖洗干凈再調(diào)節(jié)液面） 。整個裝柱過程中，正己烷可回收循環(huán)使用。將1mL待凈化濃縮樣品用滴管移入凈化柱中，浸泡 5min以上，保證樣品與凈化柱充分接觸交換。洗脫：以 15mL正己烷分三次洗滌盛有二氯甲烷樣品的 K-D濃縮器，均用滴管移入凈化柱中，然后以 90滴/min左右的流速流出，并繼續(xù)添加正己烷，使洗脫溶劑總體積為 100mL，直至流干，洗脫液用 250mL平底燒瓶收集。5.4. 待測樣制備收集液濃縮后轉(zhuǎn)移至 KD濃縮管，用柔和的氮氣吹蒸定容至 0.2ml，作為儀器分析待測樣。待測液定容后轉(zhuǎn)移至 GC自動進樣用的樣品瓶中，用壓蓋器密封后存放Page6/6水生態(tài)毒理研究組 環(huán)境樣品中污染物分析方法規(guī)范 1于冰箱中待測。分析測定方法6.1. 色譜條件HP-5石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm）；檢測器放射源為63Ni；進樣口溫度：280℃；檢測器溫度：300℃；載氣：高純氮氣，恒流2.5mL/min；無分流進樣1μL。升溫程序為：始溫60℃保留2min，15℃/min升至180℃保留10min，再以4℃/min升至250℃。6.2. 定性與定量目標化合物定性利用多氯聯(lián)苯混合標樣 6次平行分析的平均保留時間對照各色譜峰保留時間對實際樣品中的農(nóng)藥進行定性 (標準樣品色譜圖見圖 1)。樣品中有機氯農(nóng)藥的含量用內(nèi)標峰面積法定量。質(zhì)量保證與控制(QA/QC)體系7.1. 質(zhì)量保證/質(zhì)量控制目標：QA:QualityAssurance,準確性、精密性、可比性QC:QualityControl,較高的可靠性MDL:在99%以上的置信度，某物質(zhì)可被可檢出和報告的最低濃度。應(yīng)至少分析3個以上的含預(yù)計方法限濃度3-5倍的目標化合物的攙混樣品獲得MDL7.2. 質(zhì)量保證/質(zhì)量控制體系要求：7.2.1. 質(zhì)量控制樣品：空白樣品，空白加標樣，基質(zhì)加標樣，重復(fù)樣 (每20個測試樣品同時完成一組質(zhì)量控制樣品的測試 )。目標化合物回收率：通過空白加標樣品的測定，得到目標化合物的回收率。Page7/6水生態(tài)毒理研究組 環(huán)境樣品中污染物分析方法規(guī)范 1儀器檢測限(IDL)：測定空白樣品(n=6)的5倍最小噪音(noise),儀器檢測限(IDL)等于3.36乘以5倍最小噪音的標準偏差(n=6),驗證儀器狀態(tài)。方法檢測限(MDL):基質(zhì)加標樣(n=6)測定，根據(jù)U.S.EPA方法檢測限測定公式計算出本實驗流程(方法)對各種目標化合物的檢測限，判斷本實驗方法對實際樣品中目標化合物檢測數(shù)據(jù)的可信度。校正曲線：內(nèi)標(I.S)定量法.多點校正(n=6),要求RRF的RSD%<25%。7.2.6. 工作曲線：用新配制的標樣，測定值與已知值 (校正曲線)<20%.備注在整個樣品制備過程中避免樣品的污染；第一次進行多氯聯(lián)苯測定人員必須經(jīng)過有經(jīng)驗人員培訓(xùn)之后方可獨自進行操作；實驗過程中出現(xiàn)問題請及時與許宜平聯(lián)系；發(fā)現(xiàn)本操作方法體系有