離子交換柱層析分離純化蔗糖酶

關(guān)于離子交換柱層析分離純化蔗糖酶第一頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)離子交換層析的基本原理；2、學(xué)習(xí)離子交換層析分離蛋白質(zhì)的基本方法和技術(shù)；3、學(xué)習(xí)蔗糖酶活性檢測(cè)的基本原理和方法。

二、實(shí)驗(yàn)基本原理1、離子交換層析離子交換層析是常用的層析方法之一。它是在以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。這些過程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白質(zhì)所帶的電荷存在差異，因而與離子交換劑的親和力就有區(qū)別。當(dāng)洗脫液的pH改變或者鹽的離子強(qiáng)度逐漸提高時(shí)，使某一種蛋白質(zhì)的電荷被中和，與離子交換劑的親和力降低，不同的蛋白質(zhì)按所帶電荷的強(qiáng)弱逐一被洗脫下來，達(dá)到分離的目的。第二頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)（或功能基團(tuán)）和反離子構(gòu)成?；|(zhì)電荷基團(tuán)反離子陽離子交換劑電荷基團(tuán)反離子陰離子交換劑電荷基團(tuán)反離子基質(zhì)基質(zhì)—＋—＋—＋溶液中的離子或離子化合物溶液中的離子或離子化合物可逆交換可逆交換＋—第三頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三第四頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三2、酶活力檢測(cè)(定性檢測(cè)）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2－糖苷鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol還原糖。還原糖的測(cè)定有多種方法，如采用3.5－二硝基水楊酸法，其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。本實(shí)驗(yàn)在離子交換層析分離純化的過程中，對(duì)分離純化樣品采用3.5－二硝基水楊酸法來初步判定樣品中還原糖含量的多少，由此來確定并收集蔗糖酶純化樣品。第五頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料蔗糖酶粗分離純化樣品Ⅲ2、實(shí)驗(yàn)試劑⑴DEAE-SepharoseFastFlow(弱堿性陰離子交換劑)；⑵20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液；⑶20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3緩沖液(學(xué)生自配）；⑷0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5；⑸5%蔗糖溶液；⑹3，5-二硝基水楊酸試劑甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液.

甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。第六頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、高速冷凍離心機(jī)；2、層析柱（φ1.0×20㎝）(1支/組）；3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1臺(tái)/組）；4、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/組）；5、核酸蛋白檢測(cè)儀（靈敏度0.5A）（1臺(tái)/組）；6、記錄儀（紙速：0.5mm/min；靈敏度：50mV）（1臺(tái)/組）；7、部分收集器及收集試管（4ml/管）（1臺(tái)/組）；8、鐵架臺(tái)、夾子（固定層析柱用）（1套/組）；9、－20℃冰箱（保存樣品用）；10、微量移液槍200ul、1000ul；11、1.5ml離心管（留樣品Ⅲ和樣品Ⅳ用）；12、7ml離心管（留樣品Ⅳ用）；13、恒溫水?。?00℃）；14、試管、移液管、試管架等。第七頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟1、離子交換劑準(zhǔn)備：

DEAE—Sephadex，取適量DEAE—Sephadex，加入0.5mol/LNaOH溶液，輕輕攪拌，浸泡0.5小時(shí)，用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加50ml0.5mol/LHCl,攪勻，浸泡0.5小時(shí)，同上，用去離子水洗至近中性，（DEAE-SepharoseFastFlow，用后務(wù)必回收）。浸入20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液中平衡備用。

DEAE-SepharoseFastFlow，（按說明書處理）第八頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三2、樣品處理：將乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白樣品充分溶解于15ml20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液；4℃15000r/min,離心10分鐘，收集樣品上清液（樣品Ⅲ）測(cè)量總體積(ml數(shù)），留取1ml（樣品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、蔗糖酶活力的測(cè)定以及用于SDS分析；將其余樣品（樣品Ⅲ）作離子交換柱層析進(jìn)一步分離純化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力檢測(cè)）。3、純化檢測(cè)儀器連接：將梯度混合器(100ml梯度杯)，層析柱（φ1.0×20㎝），恒流泵(10rpm)（流速0.8～1ml/min），核酸蛋白檢測(cè)儀（靈敏度0.5A），記錄儀（紙速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4～5ml/管/5min）等按下圖連接并設(shè)置好。第九頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三

211、50ml20mmol/LTris-HCl，pH7.3緩沖液2、50ml20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3緩沖液梯度混合器層析柱（φ1.0×20㎝）恒流泵核酸蛋白檢測(cè)儀記錄儀部分收集器DEAE-SepharoseFastFlow純化檢測(cè)儀器連接示意圖第十頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三4、裝柱(層析柱規(guī)格1×20cm)、平衡：裝柱前先調(diào)好流速0.8ml～1ml/min，然后將柱下端的出水口關(guān)閉，加進(jìn)5ml（約1/3柱床體積）20mmol/LTris-HCl、pH7.3的緩沖液，然后將處理好的DEAE—SepharoseFastFlow，輕輕攪勻（注意不能太稀，也不能太稠，剛好呈流質(zhì)狀態(tài)）沿玻棒靠近柱管壁慢慢連續(xù)加進(jìn)柱內(nèi)至層析柱上端。注意不能帶進(jìn)氣泡，待凝膠自然沉積離柱管上端約1-2cm后松開層析柱出口，控制流速0.8ml～1ml/min；待柱內(nèi)DEAE—SepharoseFastFlow凝膠沉降至穩(wěn)定高度并分出水層后，吸去水層，用玻棒將沉降界面攪勻，再補(bǔ)加處理好的DEAE—SepharoseFastFlow凝膠，直到凝膠沉降至穩(wěn)定高度距層析柱上端約3cm處為止（這時(shí)須保持DEAE—SepharoseFastFlow凝膠柱面平整）。用20mmol/LTris-HCl、pH7.3的緩沖液連通層析柱，進(jìn)行柱平衡，直到流出液與緩沖液的pH一致。5、加樣：停止加入20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液。待緩沖液液面與膠體表面相切時(shí)，恒流泵停止工作。用膠頭滴管緩慢將蔗糖酶蛋白樣品溶液（樣品Ⅲ）加入層析柱中，注意順著柱壁滴加，盡可能保持膠面平整。打開恒流泵，使樣品溶液進(jìn)入膠體，待樣品溶液完全進(jìn)入膠體后，用少量洗脫緩沖液將殘余在層析柱壁上端的樣品洗下，并完全進(jìn)入膠體后，再加洗脫緩沖液至一定高度。第十一頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三6、洗脫：方法1——梯度洗脫法：加樣后，用20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液進(jìn)行平衡，洗脫流速為0.8ml～1ml/min，洗去未被DEAE—SepharoseFastFlow凝膠吸附的雜蛋白，待層析柱流出液在核酸蛋白檢測(cè)儀上繪出的基線穩(wěn)定，用20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液NaCl梯度洗脫（濃度為0-1mol/LNaCl），層析柱聯(lián)上梯度混合器，混合器中分別為50ml0.05mol/LTris-HClpH7.3緩沖液和50ml含1mol/LNaCl的0.05ml/LTris-HClpH7.3緩沖液。洗脫流速為0.8～1ml/min，每4ml接一管，洗脫至緩沖溶液流完為止。跟蹤測(cè)定各管的蔗糖酶活力，將蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，測(cè)量總體積（ml數(shù)）（樣品Ⅳ），并留樣用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、蔗糖酶活力測(cè)定、SDS分析、酶的基本性質(zhì)實(shí)驗(yàn)和用于“用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活性的影響”（半自主性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)），樣品低溫－20℃保存。第十二頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三方法2、一步洗脫法：上樣后，用20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液進(jìn)行平衡，洗脫流速為0.8ml～1ml/min，洗去DEAE－SepharoseFastFlow未吸附的雜蛋白，待層析柱流出液在核酸蛋白檢測(cè)儀上繪出的基線穩(wěn)定。用0.15mol/LNaCl20mmol/LTris-HClpH7.3緩沖液繼續(xù)洗脫被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脫流速為0.8ml～1ml/min，4ml/管/5min，直至待層析柱流出液在核酸蛋白檢測(cè)儀上繪出的基線穩(wěn)定。測(cè)定各接收管的蔗糖酶活力，將蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，量出總體積（ml數(shù)）（樣品Ⅳ），并留樣用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、蔗糖酶活力測(cè)定和SDS分析以及用于“用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活性的影響”（半自主性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)），樣品低溫－20℃保存。第十三頁，共十八頁，編輯于2023年，星期三7、蔗糖酶活力檢測(cè)空白對(duì)照樣品管0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.50.5ml0.5ml5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml蒸餾水1.0ml0.9ml分離純化樣品溶液/0.1ml

50℃水浴10min3.5－二硝基水楊酸試劑1.0ml1.0ml

100℃水浴5min蒸餾水5ml5ml觀察顏色

收集活力高的蔗糖酶液，測(cè)量總體積(ml數(shù))（樣品Ⅳ），-20℃保存，用于蔗糖酶蛋白含量測(cè)定、蔗糖酶活力測(cè)定和SDS分析以及用于用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活性的影響（限定性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)）。樣品低溫－20℃保存。第十四頁，共十八頁，編輯于2023年