間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用心得

內(nèi)容MSCs的生物學(xué)特性MSCs的免疫調(diào)控作用MSCs與免疫細(xì)胞（T、B、DC、NK、CTL）MSCs的免疫調(diào)控機(jī)制MSCs的臨床應(yīng)用當(dāng)前1頁，總共41頁。間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性來源廣泛自我更新、多向分化潛能易擴(kuò)增傳代能力MSCsIL-6,IL-7,IL-10,IL-11,SCF,SDF-1GM-CSF,M-CSF..adipocyteosteocytechondrocytemyoblastcardiocyteNervecellhepatocyte可來源于骨髓、胰腺、皮膚、肺臟等多處器官組織

體外能夠傳40代，并保持穩(wěn)定的表型和多向分化的潛能（MesenchymalStemCells，MSCs)當(dāng)前2頁，總共41頁。免疫調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生多種細(xì)胞因子分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等表達(dá)多種細(xì)胞表面分子CD105、CD73、CD44、CD71、CD90、CD166、基質(zhì)細(xì)胞抗原（STRO-1）等無MHC限制不管MSCs或T細(xì)胞來源種類，MSCs均能對(duì)T細(xì)胞增殖產(chǎn)生免疫抑制作用當(dāng)前3頁，總共41頁。狼瘡骨髓MSCs（BMSCs）SLE骨髓（P0）MSCs第25d倒置顯微鏡觀察×100人正常人與SLE患者BMSCs形態(tài)大小上無差異，均以長(zhǎng)梭形為主孫凌云等，中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2005形態(tài)觀察當(dāng)前4頁，總共41頁。SLE組正常對(duì)照組原代培養(yǎng)時(shí)間26±7.76d17±5.46dP=0.029形態(tài)學(xué)無區(qū)別SLE與正常對(duì)照組BMSCs培養(yǎng)比較張華勇，孫凌云，中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006擴(kuò)增效率P5代后降低P10代后降低

當(dāng)前5頁，總共41頁。表達(dá)CD29、CD44和CD105

不表達(dá)CD14、CD34、CD45、HLA-DR正常組與狼瘡組表型表達(dá)并無差異（P<0.05)張華勇，孫凌云，中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006表面標(biāo)記測(cè)定當(dāng)前6頁，總共41頁。dCellpopulation生長(zhǎng)曲線呈S形SLE患者BMSCs總體生長(zhǎng)較正常人緩慢

張華勇，孫凌云，中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006正常人與SLE患者BMSCs生長(zhǎng)曲線比較當(dāng)前7頁，總共41頁。對(duì)照SLEBeta-actinIL-7SLE中IL-6、IL-7表達(dá)降低（P<0.05）而IL-11,M-CSF表達(dá)無區(qū)別張華勇，孫凌云，中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006正常人與SLE患者BMSCs細(xì)胞因子表達(dá)比較當(dāng)前8頁，總共41頁。張華勇，孫凌云，中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006SLE患者BMSCs染色體組型——為正常的染色體組型當(dāng)前9頁，總共41頁。鼠

BALB/cNZBWF1/J（P0）×100

形態(tài)上無顯著差異但狼瘡MSCs增殖速度更快、傳代時(shí)間更短不同于人？SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006形態(tài)學(xué)當(dāng)前10頁，總共41頁。MSCs與免疫細(xì)胞MSCs與T細(xì)胞不活化異基因T細(xì)胞抑制T細(xì)胞增殖包括初始和記憶性T細(xì)胞的增殖包括同種異基因抗原、絲裂原或抗原特異性刺激對(duì)T細(xì)胞凋亡影響一：不誘導(dǎo)靜止期T細(xì)胞凋亡（TseWTetal.Transplantation，2003，75：389-397.）二：誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞凋亡（PlumasJetal.Leukemia2005;19:1597-604.）當(dāng)前11頁，總共41頁。與正常（BALB/c）及狼瘡鼠（NZBWF1/J）BMSCs共培養(yǎng)均導(dǎo)致活化的T細(xì)胞凋亡下降（P<0.05)三：使活化的T細(xì)胞凋亡降低SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006單獨(dú)T細(xì)胞T＋狼瘡BMSCsT＋正常BMSCs當(dāng)前12頁，總共41頁。1.正常鼠BMSCs對(duì)狼瘡T細(xì)胞IFN-γ、IL-4生成的影響IFN-γ生成T細(xì)胞被刺激增多IL-4生成T細(xì)胞被抑制減少正常BMSCs可促進(jìn)TH1而抑制TH2細(xì)胞生成—影響SLE病情DengW,etal.DNAandCellBiology.2005;24:458-463對(duì)T細(xì)胞亞群的影響T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定當(dāng)前13頁，總共41頁。

與正常鼠BMSCs(BALB/c)共孵育：↑IFN-γ*,IL-12*IL-4*,IL-10,IL-6，TNF-α*

向TH1偏移與狼瘡鼠BMSCs(NZBWF1/J)共孵育：↑IL-6*,IL-4,IL-10

↓TNF-α*

向TH2偏移#*##*##*2.BMSCs與正常T細(xì)胞共孵育前后細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的變化SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006*為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義當(dāng)前14頁，總共41頁。

T-betβ-actinA.T＋狼瘡MSCs

B.單獨(dú)TC.T＋正常MSCsGATA-3β-actin

ABCABC與正常鼠BMSCs共培養(yǎng)：T-bet↑，GATA-3↓TH1↑與狼瘡鼠BMSCs共培養(yǎng)：T-bet↓，GATA-3↑TH2↑轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3

SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006當(dāng)前15頁，總共41頁。正常MSCs：使TH1/TH2平衡向TH1偏移狼瘡鼠病情緩解？狼瘡MSCs：使TH1/TH2平衡向TH2偏移狼瘡鼠病情惡化？

狼瘡鼠BMSCs對(duì)T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能存在缺陷對(duì)TH1/TH2平衡影響當(dāng)前16頁，總共41頁。MSCs與B細(xì)胞人BMSCs可抑制B細(xì)胞增殖增殖抑制與B細(xì)胞的凋亡無關(guān)，而與細(xì)胞周期滯留于G0/G1有關(guān)由可溶性細(xì)胞因子介導(dǎo)（不需細(xì)胞間直接接觸）抑制抗體生成(IgA、IgM、IgG)CorcioneA,etal.Blood.2006;107:367-372當(dāng)前17頁，總共41頁。MSCs與NK細(xì)胞靜止期NK不能裂解人MSCs。IL-2活化的自體及異體NK細(xì)胞均可裂解BMSCsBMSCs抑制IL-2誘導(dǎo)的靜止期NK細(xì)胞的增殖，部分抑制已活化NK細(xì)胞的增殖經(jīng)IFN－γ預(yù)處理可抑制該裂解作用—上調(diào)MSCs的HLA-Ⅰ類分子水平阻止NK細(xì)胞的活化SpaggiariGM,etal.Blood.2006;107:1484-1490NK對(duì)MSCs的裂解作用.（E/T即NK/MSC）

當(dāng)前18頁，總共41頁。MSCs與DC細(xì)胞人BMSCs與DC共培養(yǎng)對(duì)DC分化、成熟、功能影響

顯著抑制單核細(xì)胞向DC分化（無需細(xì)胞間接觸）

抑制DC分泌TNF-α的能力引起免疫耐受成熟DC（CD83、HLA-DR、CD1a、CD80、CD86）表達(dá)↓，IL-12分泌↓向非成熟狀態(tài)的偏離對(duì)同種T細(xì)胞的活化能力下降

JiangXXetal.Blood，2005;105:4120-4126

當(dāng)前19頁，總共41頁。MSCs與CTL抑制CTLs的細(xì)胞毒作用呈時(shí)間和劑量依賴不能抑制已活化CTLs的細(xì)胞毒作用通過可溶性因子介導(dǎo)

MSCs不是CTLs作用的靶細(xì)胞RasmussonI,etal.Transplantation，2003，76:1208-1213

當(dāng)前20頁，總共41頁。MSCs的免疫調(diào)控可能機(jī)制MSCs分泌可溶性細(xì)胞因子

CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）

誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性APCs

當(dāng)前21頁，總共41頁。機(jī)制分泌可溶性細(xì)胞因子介導(dǎo)

IL-10、TGF-β1、前列腺素E2（PGE2）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、IL-2、IL-2R等不需要細(xì)胞間直接接觸矛盾觀點(diǎn)不同細(xì)胞因子介導(dǎo)需要與T細(xì)胞直接接觸不同的來源、提取、培養(yǎng)、鑒定方法等可能導(dǎo)致收集的MSCs亞群不同（見下表）當(dāng)前22頁，總共41頁。Extractionsites(Prinzetal.,1999)Bonemarrow(livedonors）:hip,sternum,brokenbonesBonemarrow(cadaverdonors):allsites(rare)Othertissue:teeth,fat,muscle,cartilage,synovialfluid,skinDevelopmentaltissue:foetal,umbilical,placentaDissociationmethodTrypsinationScrapingSuspensioncultureMarkercombinationsCD10+,CD13+,CD34+,CD56+,CD90+,MHC-1+(Youngetal.,1999)VCAM+,STRO-1+,CD73+,CD105+(Tulietal.,2003)Wnt2+,Wnt4+,Wnt5a+,Wnt11+,Wnt16+,Fz2+,Fz3+,Fz4+,Fz5+,Fz6+(Etheridgeetal.,2004)…IdentificationAdherencetoplasticMagneticbeadFACScellsortingOtherfactorsCelllineorexvivoDonorageDonorsexDonordiseasestatusMediumcompositionPointoffirstanalysisCultureconditions(temperature,motion,etc.)DifferentiationagentFrequencyofmediumchange…SetheS,etal.AgeingResearchReviews.2006;5:91-116當(dāng)前23頁，總共41頁。DjouadF,etal.Blood.2003;102:3837-3844誘導(dǎo)CD8+調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞產(chǎn)生MSCs作用的靶T細(xì)胞—CD8+亞群通過誘導(dǎo)CD8+調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用Condedsplenocytes+MSCMLR鼠BMSCs抑制MLR中CD8+亞群的增殖CD8+亞群抑制淋巴細(xì)胞增殖當(dāng)前24頁，總共41頁。吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）介導(dǎo)BMSCs在IFN-γ的誘導(dǎo)下大量表達(dá)IDO

色氨酸犬尿素

抑制T細(xì)胞抗原應(yīng)答色氨酸加入Ｔ細(xì)胞的增殖可顯著恢復(fù)

IDO-介導(dǎo)的色氨酸降解—人BMSCs抑制T細(xì)胞增殖MeiselR,etal.Blood.2004;103:4619-4621當(dāng)前25頁，總共41頁。誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性APCs產(chǎn)生人BMSCs可能干涉APCs的成熟轉(zhuǎn)變?yōu)檎{(diào)節(jié)性APCs

BeythS,etal.Blood.2005;105:2214-2219缺乏T細(xì)胞活化能力接觸依賴性伴前炎癥分子IL-12,TNF-α，MHC-Ⅱ表達(dá)↓抗炎癥細(xì)胞因子IL-10表達(dá)↑MSCs調(diào)節(jié)性APCs防止或減輕GVHD當(dāng)前26頁，總共41頁。MSCs的臨床應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)無或低免疫原性

無MHC限制誘導(dǎo)宿主免疫耐受降低移植排斥反應(yīng)當(dāng)前27頁，總共41頁。體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs作為組織工程的種子細(xì)胞，修復(fù)各種組織、器官作為基因治療的載體細(xì)胞：轉(zhuǎn)基因或基因修飾MSCs植入，替代有缺陷的骨髓利用免疫抑制、降低移植排斥，用于器官或組織移植與HSCs共移植治療血液、腫瘤、免疫性等臨床疾病防治GVHD

主要應(yīng)用皮膚骨、軟骨、肌腱關(guān)節(jié)腦神經(jīng)組織心肌等當(dāng)前28頁，總共41頁。

DiseaseNo.SourceofMSCs/SCTOutcomeRef.StudyPatientsSettingHematologic15AutologousIVNoadverseeventsof1,Lazarusetal.malignanciesinfusion10,and50×106cellsBreastcancer28AutologousinIVinfusionwassafe;Ko?etal.autologousSCTautologousSCTrecoverywasrapidInbornerrorsof11HLA-identicalNoimmuneresponseagainstkocetal.MetabolismfromSCTdonordonor;improvednerveconductiovelocityinmetachromaticleukodystrophyOsteogenesis5HLA-identicalfromGene-markedMSCsengrafted;Horwitzetal.ImperfectaSCTdonornewdenseboneformation;fewfracturesAcutemyeloid1HLA-haploidenticalSCTengraftmentwithnoGVHDLeeetal.LeukemiafromSCTdonorLeukemia31HLA-identicalfromRapidplateletengraftment;lowrassonietal.SCTdonorincidenceofacuteGVHDSevereaplastic1AllogeneicMSCEngraftment;improvedstromaFouillardetal.anemiaSevereacute1HaploidenticalMSC;ClearanceofgradeIVacuteLeBlancetal.GVHDunrelateddonorSCTGVHD,twice

MSCs與HSCs共移植的臨床研究LeBlancC,etal.BiologyofBloodandMarrowTransplantation.2005;11:321-334當(dāng)前29頁，總共41頁。1.血液疾病女，20歲，急性白血病—全身照射+傳統(tǒng)化療—5.7×106CD34+cells/kg+1.5×106MSCs/kg（來自患者父親）—無急性GVHD或慢性GVHD發(fā)生—移植后31月血象正常，無病情復(fù)發(fā)LeeST,etal.BrJHaematol.2002;118:1128-1131.當(dāng)前30頁，總共41頁。2.腫瘤28名乳腺癌患者－接受高劑量化療＋自體干細(xì)胞移植－靜脈輸注1～2×106/kg

MSCs－無輸注后毒性反應(yīng)發(fā)生－治療后血小板>0.5×109/L的平均時(shí)間9d(4-19d)中性粒細(xì)胞>0.5×109/L的平均時(shí)間8d(6-11d)KocON,etal.ClinOncol,2000;18:307-316MSCs可促進(jìn)HSCs移植當(dāng)前31頁，總共41頁。3.GVHD（移植物抗宿主?。镠SCT常見并發(fā)癥（20％－60％）預(yù)防方法

傳統(tǒng)移植物中除去供者T細(xì)胞（體外T細(xì)胞清除）T細(xì)胞抗體處理(體內(nèi)T細(xì)胞清除）免疫抑制藥物使用新策略MSCs輸注下調(diào)宿主抗原呈遞細(xì)胞當(dāng)前32頁，總共41頁。31名患者接受HLA相匹配的同胞HSCs＋MSCs移植MSCs劑量1－5×106/kg無MSCs輸注相關(guān)毒性反應(yīng)急性II～I(xiàn)VGVHD發(fā)生率為15%(對(duì)照組40%,P=0.01)慢性GVHD發(fā)生率為12%（對(duì)照組67%,P=0.002)6月存活率88%（對(duì)照組67%)ASCT同時(shí)輸入MSCs可促進(jìn)移植，降低GVHD,提高生存率FrassoniF,etal.BoneMarrowTransplant2002;29(suppl2)當(dāng)前33頁，總共41頁。MSCs治療急性GVHD一例男，9歲，急性淋巴細(xì)胞白血病HSCT后發(fā)生Ⅳ型急性GVHD癥狀：腹瀉，高膽紅素血癥，反復(fù)細(xì)菌、真菌、病毒感染常規(guī)抗GVHD治療無效移植后73d予靜脈輸注2×106/kg

MSCs（來自患者母親），第170d予1×106/kg

MSCs治療效果：癥狀好轉(zhuǎn)至消失，血膽紅素正常，急淋緩解該中心1000例接受異基因HSCT患者中，25例發(fā)生急性Ⅳ型GVHD，除此例外，另24例均死亡（移植后0.5－5.5月，平均2月）如下圖當(dāng)前34頁，總共41頁。患者移植臨床過程LeBlancK，etal.Lancet.2004;363:1439–41結(jié)論:

利用MSCs的免疫抑制作用可治療急性GVHD當(dāng)前35頁，總共41頁。MSCs治療激素難控制型急性GVHD8例治療組例數(shù)/次數(shù)急性GVHD8慢性GVHD1MSCs治療1次6MSCs治療2次3移植后急性GVHD消失