基礎毒理學課件：第八章 毒理學實驗基礎

第八章毒理學實驗基礎3/25/20231MechanisticToxicologyDescriptiveToxicologyRegulatoryToxicology危險度評價3/25/20232毒理學實驗研究整體水平器官水平細胞水平分子生物學水平3/25/20233第一節(jié)實驗設計原則實驗設計是順利進行科學實驗的先決條件，是實驗過程遵從的依據，是實驗數(shù)據處理的前提。良好的實驗設計是保證實驗結果質量的重要前提，其主要作用是減少誤差，提高效率。3/25/20234第一節(jié)實驗設計原則在實驗設計時，要充分考慮實驗的科學性和邏輯性，使研究結果具有重現(xiàn)性，更可靠，更科學，經得起時間的考驗。3/25/20235一、實驗設計的基本要素受試對象處理因素實驗效應3/25/20236受試對象：即處理因素作用的對象，根據研究目的而定。在毒理學實驗中，根據試驗對象的層次主要分為整體動物試驗、組織器官試驗、細胞試驗和分子生物學試驗。3/25/20237對受試對象的總的要求是同質性和代表性。一是對處理因素要敏感二是對處理因素的反應要穩(wěn)定3/25/20238處理因素：根據試驗目的要觀察的、能引起受試對象產生效應的因素稱為處理因素。一般在一個試驗中只設計一個處理因素，但對該處理因素應設多個處理水平。如對某一藥物的毒性進行觀察時，要設計多個劑量組。3/25/20239混雜因素(confounder)與處理因素共存，并能使受試對象產生效應的非處理因素?；祀s因素是干擾試驗結果的重要因素，因此，要盡量將其排除。3/25/202310實驗效應：是處理因素作用于受試對象后的反應和結局。以實驗中受試對象的某項(或某些項目)指標的變化來表示。這些指標應該具有客觀性，精確性，特異性和靈敏性。3/25/2023111.客觀性：是指該指標能用確定的標準來進行判斷，而不受主觀因素的影響。如某種酶活性的變化，它有具體的測定值，是一個客觀的指標。如果觀察動物活動能力的變化，則是一個主觀的指標，難以準確進行描述和定量。2.精確性：包括準確度和精密度。準確度指的是指標的測定值與真值的接近程度。精密度指多次測定結果的相符合程度。好的指標應該是既準確又精密。3/25/2023123.特異性：在毒理學上，特異性主要指對所測試的處理因素的特異反應，能夠反應處理因素的某種特定的效應。如四氯化碳引起肝臟損害，肝臟的病理學變化和功能變化對四氯化碳來說就是一個相對特異的指標。4.靈敏性：靈敏性是指某個指標對受試因素的反應性較高，在較低劑量下即可有該指標的明顯變化。高靈敏性有利于對受試因素的有害效應進行評價和監(jiān)測。3/25/202313二、實驗設計的基本原則對照(control)隨機化(randomization)重復(replication)3/25/202314（一）對照原則對照性原則是要求在實驗中設立可與實驗組(experimentalgroup)比較以消除各種無關因素影響的對照組(controlgroup)

。實驗組和對照組具有同等重要的意義。設置對照的目的是減少或消除非實驗因素干擾造成的誤差。3/25/202315（一）對照原則對照應有可比性，即在“同時同地同條件”下進行。自體對照是指在同一個體身上觀察實驗處理前后某種指標的變化。。組間對照是指將若干受試對象隨機分成若干平行組，隨機挑選一組作為對照組，其它組作為實驗組，進行實驗比較。3/25/202316

1.空白對照(blankcontrol)

即對照組不接受任何處理因素。這在動物實驗和實驗室方法研究中最常見，常用來評定測量方法的準確度，觀察實驗是否處于正常狀態(tài)等。例如，在實驗中設置空白對照或試劑對照，以檢測本底值。3/25/2023172.陽性對照（positivecontrol）給予標準的陽性物質處理或經典的治療(處理)方法作為陽性對照。如，在檢測某物質的雌激素效應時，選擇雌二醇作為陽性對照。在測定某毒物對神經系統(tǒng)的成癮性時，常以嗎啡作為陽性對照。3/25/202318（二）隨機化原則隨機化是采用隨機的方式，使每個受試對象都有同等的機會被抽取或分到不同的實驗組或對照組。隨機化是應對大量不可控制非處理因素的另一個重要手段，它使不可控制的混雜因素在實驗組和對照組中的影響相當，并可歸于實驗誤差之中；它也是對資料進行統(tǒng)計推斷的前提。3/25/202319隨機化應貫穿于研究設計和實施的全過程，具體體現(xiàn)在如下三個方面：①抽樣的隨機：②分組的隨機：③實驗順序的隨機：3/25/202320（三）重復原則重復是指在相同實驗條件下進行多次研究或多次觀察，以提高實驗的可靠性和科學性。重復包括三種情形:1.整個實驗的重復：確保實驗的重現(xiàn)性，提高實驗的可靠性。2.用多個受試對象進行重復：避免把個別當普遍，把偶然當必然。3/25/2023213.同一受試對象的重復觀察：保證觀察結果的精度。重復最主要的作用是估計實驗誤差。重復的另一作用就是降低實驗誤差，多次重復測定的均數(shù)誤差較小。3/25/202322一般估測的樣本數(shù)

動物種類每組例數(shù)計量資料（每組）計數(shù)資料（每組）小動物（小鼠、大鼠、蛙、魚）10~30≧10≧30中等動物（豚鼠、家兔）8~20≧8≧20大動物（犬、貓、豬、羊）6~20≧6≧203/25/202323第二節(jié)整體動物實驗3/25/2023243/25/2023253/25/2023263/25/2023273/25/2023283/25/2023293/25/2023303/25/202331一、實驗動物的選擇相似性原則特殊性原則標準化原則規(guī)格化原則經濟性原則3/25/202332（1）相似性原則相似性原則是指利用動物與人類某些機能、代謝、結構及疾病特點的相似性選擇實驗動物。3/25/2023331．組織結構方面如豬的皮膚組織結構與人類的相似，其上皮再生、皮下脂肪層、燒傷后的內分泌及代謝等也與人類相似，故選用小型豬作燒傷實驗研究較為理想。3/25/2023342．系統(tǒng)機能方面如犬具有發(fā)達的血液循環(huán)和神經系統(tǒng)，在毒理方面的反應和人類也比較接近，適于作實驗外科學、營養(yǎng)學、藥理學、毒理學、行為學等方面的研究。

3/25/2023353．生理特性方面4．繁殖特性方面5．體液成分方面3/25/2023366．解剖特性方面馬和大鼠肝的特征是缺少膽囊

；反芻動物呈復胃，由多個胃構成。單胃動物之間胃的形狀類似；在形態(tài)和機能上，與人的心臟最類似的動物是犬。3/25/2023377．疾病特點方面實驗動物有許多自發(fā)或誘發(fā)性疾病，能局部或全部地反映與人類類似疾病過程與特點，可用于研究相關的人類疾病。如突變系SHR大鼠，其自發(fā)性高血壓的變化與人類相似，并伴有高血壓性心血管病變，如腦血栓、梗塞、出血、腎硬化等癥狀。

3/25/202338（2）特殊性原則特殊性原則是指利用不同種系實驗動物，機體存在的特殊構造或某些特殊反應選擇解剖、生理特點符合實驗目的和要求的動物。3/25/202339如犬適宜做甲狀旁腺摘除實驗；兔宜做甲狀腺摘除后研究甲狀旁腺功能的實驗；觀察減壓神經對心臟的作用；做開胸和心臟實驗

。大鼠肝臟再生能力很強，適合肝外科實驗研究。但不能用來做膽囊功能研究的實驗。3/25/202340大鼠垂體-腎上腺系統(tǒng)功能發(fā)達，應激反應靈敏，且各種內分泌腺體如垂體、腎上腺、卵巢易于摘除，適于做應激反應和內分泌實驗研究。大鼠的踝關節(jié)對炎癥十分敏感，適于多發(fā)性關節(jié)炎和化膿性淋巴腺炎的研究。

3/25/202341（3）標準化原則標準化原則是指動物實驗中選擇和使用與研究內容相匹配的標準化的實驗動物。3/25/202342為了保證實驗結果的準確性和重復性，使用標準化實驗動物是極其重要的。只有選用經遺傳學、微生物學、環(huán)境及營養(yǎng)控制的標準化實驗動物，才能排除微生物及潛在疾病對實驗結果的影響，排除因遺傳污染而造成的個體差異。3/25/202343選擇何種遺傳群動物，應根據不同的課題內容而定。近交系動物由于遺傳純合度高，個體差異小，特征穩(wěn)定，對實驗反應一致性好，實驗結果精確可靠而得到越來越廣泛應用。選擇何種微生物等級的實驗動物，也應根據各級動物的特點，結合課題研究的水平、內容及目的而定。3/25/202344實驗動物分級：實驗動物按照微生物和寄生蟲控制的等級，一般分為以下四個等級普通級清潔級無特定病原體級（SPF）無菌級3/25/202345（4）規(guī)格化原則是指選擇與實驗要求一致的動物規(guī)格。由于不同動物對外界刺激的反應存在著個體差異，選擇時，除了注意動物的種類及品系外，還應考慮到動物的年齡、體重、性別、生理及健康狀況等要求，這也是保證實驗結果可靠性和可重復性的一個重要環(huán)節(jié)。3/25/202346（5）經濟性原則是指盡量選用容易獲得、價格便宜和飼養(yǎng)經濟的動物。在不影響整個實驗質量的前提下，盡量做到方法簡便和降低成本。選用易于獲得、最經濟和最易飼養(yǎng)管理的實驗動物。3/25/202347毒理學研究中，要求最好使用兩種動物進行試驗，而且它們的種屬差異越大越好。一般應包括一種嚙齒類動物和一種大動物，如選用大鼠和犬。犬在毒理方面的反應和人類方面接近。在選用嚙齒類動物時，以使用近交系動物更為適宜，以減少個體差異。3/25/202348在實驗動物年齡方面，毒理學研究要求選用未成年的較為合適。因為在動物迅速生長時期進行藥物的毒性試驗，可以發(fā)現(xiàn)藥物對生長及各器官，包括性器官成熟的影響。慢性試驗開始時選擇的小鼠年齡最好在2～3周、體重為8～9g，大鼠不超過3周、體重約50～60g。3/25/202349二、常用實驗動物品系介紹(一)小鼠：1.生活習性(1)生長發(fā)育：小鼠在哺乳動物中體型最小，新生仔鼠1.5g左右，45天體重達18g以上。(2)活動規(guī)律：小鼠性情溫順，易于捕捉，膽小怕驚，對外來刺激敏感，喜居光線暗淡的環(huán)境。習慣于晝伏夜動.(3)采食特性：小鼠門齒生長較快，需?？幸杂彩澄?，有隨時采食習慣。3/25/202350(4)繁殖特性：小鼠性成熟早，繁殖力強，壽命l～3年。雌鼠35～50日齡性成熟，配種一般適宜在65～90日齡，妊娠期19～21天，每胎產仔8～12只。(5)群居特性：群養(yǎng)時雌雄要分開，雄鼠群體間好斗，群體中處于優(yōu)勢者保留胡須，而處于劣勢者則掉毛，胡須被拔光。(6)溫濕度要求：小鼠對溫、濕度很敏感，一般溫度以18～22℃，相對濕度以50%～60%最佳。3/25/202351小鼠常用品系近交系(inbredstrain)如A、BALB/c、C3H、DBA等。突變系(mutantstrain)如nude、scid等。封閉群(closedcolony)，又稱遠交群(outbredstock)如KM、ICR等。3/25/202352KM小鼠DBA/2J3/25/202353(1)BALB/c小鼠：BALB/c小鼠基因型為Aabbcc，屬近交系小鼠，毛色為白色。其乳腺癌發(fā)病率低，但對致癌因子敏感。血壓與其他近交系小鼠相比為最高，有自發(fā)高血壓癥。老年小鼠心臟有某些病變，雌雄小鼠常有動脈硬化。BALB/c小鼠生產性能好，繁殖期長，一般無互相侵襲習性，比較容易群養(yǎng)。3/25/202354(2)Nude小鼠：即裸小鼠，該小鼠先天性無胸腺，其T淋巴細胞功能缺陷。裸小鼠純合子全身幾乎無毛，偶見背部有稀疏的帶狀毛，皮薄有皺折。皮膚色素BALB/c-nu為淺紅色，白眼；C3H-nu為灰白色，黑眼；C57Blnu為黑灰色至黑色，運動功能正常。3/25/202355裸小鼠缺乏正常T細胞功能。但其B淋巴細胞功能基本正常。裸小鼠是腫瘤學等方面研究難得的材料，是醫(yī)學研究領域中不可缺少的模型動物之一。3/25/202356(3)KM小鼠：即昆明小鼠，一直是我國生產量、使用量最大的遠交群小鼠，被廣泛應用于藥理學、毒理學等領域的研究，以及藥品、生物制品的生產與鑒定。昆明小鼠于1993年被收錄入InternationalIndexofLaboratoryAnimals，定名為KM鼠，獲得國際公認。3/25/202357(二)大鼠：1.生活習性（1）生長發(fā)育：新生大鼠體重約5～6g，45天體重可長到180g以上，此時可供實驗用。成年雄性大鼠體重達300～800g，雌性為200～400g。（2）活動規(guī)律：大鼠喜啃咬。白天休息，夜間活動。采食多。食性廣，喜肉食。對光照、噪音敏感。（3）繁殖特性：大鼠3月齡完全性成熟，性周期4～5天，妊娠期為19～21天，哺乳期為21天，每胎產仔平均8只。3/25/2023582.常用品系(1)Sprague–Dawley大鼠：簡稱SD大鼠，屬遠交群。其毛色呈白色，特征為頭部狹長，尾長近于身長。Sprague-Dawley大鼠產仔多，生長發(fā)育較Wistar大鼠為快，對疾病的抵抗力強。3/25/202359(2)Wistar大鼠：常用的Wistar大鼠既有近交系也有遠交群。被毛白色，特征為頭部較寬、耳朵較長、尾的長度小于身長。Wistar大鼠性情溫順,性周期穩(wěn)定，早熟多產，平均每窩產仔10只左右，生長發(fā)育快，乳腺癌發(fā)病率很低，對傳染病抵抗力強。3/25/2023603/25/202361(三)犬1.生活習性(1)活動習性：犬習慣于不停地運動，故飼養(yǎng)時應考慮有足夠的運動場地。(2)飼養(yǎng)習性：犬喜近人，易馴養(yǎng)，有服從人的意志的天性，并能領會人的簡單意圖。⑶采食習性：犬為肉食性動物，并習慣于啃咬骨頭，也可喂雜食或素食。3/25/202362⑷繁殖習性：雌犬春秋兩季發(fā)情，春季約3～5月，秋季9～ll月，發(fā)情期8～14天，妊娠期55～65天，平均窩產仔數(shù)6～8只，哺乳期45～60天，壽命達10～20年。(5)感覺特性：犬的嗅覺和聽覺特別靈敏。嗅覺靈敏度，超過人類1200倍，聽覺比人靈敏16倍。犬的品種多而雜，目前實驗用的犬常為Beagle犬,原產于英國，特點是：體型小，短毛，性情溫順，親近人，易適應環(huán)境、抗病力強，是國際公認理想的實驗用犬。3/25/2023633/25/202364三、受試物的處理要遵守嚴格的質量保證規(guī)范：（1）受試物的接受、分樣、保管、稱量、配制等程序規(guī)范。（2）了解受試物的理化性質：化學結構、純度、雜質成分、揮發(fā)性、溶解性等。3/25/202365三、受試物的處理（3）檢索文獻：與受試物化學結構和理化性質相似化學物的毒性資料。（4）計算總量，一次備齊全部實驗的用量，以同一批號為宜。受試物成分和組成應穩(wěn)定不變，異構體混合物，其異構體比例必須固定。3/25/202366（5）受試物配制：常用溶液、混懸液、油溶液。經口染毒：水溶性溶劑：蒸餾水或去離子水；混懸液：常用0.5％的羧甲基纖維素鈉、10％的阿拉伯乳膠；油溶液：天然植物油(如玉米油、橄欖油)。3/25/202367注射染毒：常用生理鹽水，保持與體內滲透壓一致。受試物一般應臨用前新鮮配制，除非已證明溶液貯存是穩(wěn)定的。3/25/202368受試物配制的濃度要根據受試物的毒性大小和實驗動物的適宜染毒量適當配制。一般推薦的最大染毒量為:①經口20ml/kg(對空腹動物)；②經皮2ml/kg(或根據體表面積計算，以保證染毒的準確性)；③靜脈lml/kg(5min以上)；3/25/202369④肌內注射0.5ml/kg(一個部位)；⑤每眼0.01ml；⑥直腸0.5ml/kg；⑦陰道：大鼠0.2ml，兔1ml；⑧吸入2mg/L；⑨經鼻滴入:猴或犬每鼻孔0.1ml。3/25/202370四、實驗動物染毒方法

原則：根據毒物進入機體的方式經口染毒：（1）灌胃（2）自由飼（代謝籠）（3）吞咽膠囊經呼吸道染毒：吸入（動式和靜式）和氣管內注入經皮膚染毒特殊的染毒方式：如化妝品的眼睛刺激性，某部分器官的特殊染毒，注射染毒等3/25/202371第三節(jié)離體器官實驗離體器官的灌流技術是在體外，通過一定的設備、裝置和條件等，模擬動物和人體器官在體內必要的存活環(huán)境，研究器官對外源化合物的代謝、屏障以及外源化合物的毒性等規(guī)律的技術，該技術將受試物在體內經過的復雜過程簡單化，利于研究受試物在特定器官的效應。3/25/202372常用離體器官灌流技術（1）離體肺灌流技術（2）離體心臟灌流技術（3）離體肝臟灌流技術3/25/202373一、離體肺灌流技術離體肺灌流技術是模擬肺在生理條件下的呼吸循環(huán)功能，利用全血或生理性灌流液對離體全肺進行灌流。研究灌流液的成分、各種內、外源性血管活性物質、藥物、毒物在肺內的代謝情況以及對肺結構、功能(尤其是肺血管功能)的影響。3/25/202374離體肺灌流技術的儀器裝備恒溫系統(tǒng)：超級恒溫器、回旋加熱管、雙層塑料盒

呼吸系統(tǒng)：小動物人工呼吸機與大鼠氣管相連灌流系統(tǒng)：恒溫泵、導管、貯液池組成記錄系統(tǒng)：壓力傳感器與計算機壓力記錄系統(tǒng)3/25/202375灌流液體：為組織提供正常代謝所需要的氧。有全血灌流與生理液體灌流兩種。

通氣氣體：生理性灌流液體：用95%的O2加5%的CO2混合氣體。全血灌流液體：CO2維持5%，O2的濃度可略降低，用N2代替部分氧氣進行灌流。

3/25/202376注意事項：（1）離體試驗的關鍵在于對整個系統(tǒng)各項指標(溫度、酸堿度等)的成功控制，使離體器官能夠處在一個較為理想的環(huán)境；（2）實驗操作要輕柔，避免造成對肺過大的人為損傷；（3）恒流泵的流量要從小到大逐漸增加進行調節(jié)，切不可在實驗開始時就將流量置于一個較大的位置上，避免導致肺水腫的發(fā)生。3/25/202377二、離體心臟灌流技術離體動物心臟灌流技術(isolatedheartperfusion)是研究離體心臟在人工控制條件下(包括一定的灌流壓力、溫度、酸堿度及各種離子、營養(yǎng)物質等)，排除神經、體液因素的影響后，各種實驗因素(包括生理試劑和藥物)對心臟活動影響的一種方法。

3/25/202378離體心臟不能等同于在體心臟。維持時間不能過久，實驗操作必須在一定時間內完成。對離體心臟灌流模型的改進有：保留部分交感神經，在灌流液中加入一定量的動物紅細胞等。3/25/202379離體心臟灌流(TIS3830/31,Langendorf)雙層灌流槽貯液瓶恒溫恒流裝置貯氣瓶送液泵3/25/202380三、離體肝臟灌流技術原理是在麻醉狀態(tài)下用外科手術使肝臟形成體外循環(huán)，用蠕動泵將含低分子量葡聚糖和氣體飽和的平衡鹽溶液替代血流進行恒速灌流，使肝臟能在一段時間內維持其正常的生理、生化機能，從而實現(xiàn)在人工控制劑量的條件下，直接研究某一化學物質在肝臟中的代謝變化以及對肝臟的作用。

3/25/202381主要目的是使肝臟具有獨立的符合生理條件的循環(huán)體系，并在嚴密控制的條件下使受試物與肝臟接觸(受試物在整體動物中預先染毒或在灌流液中加入)，繼而分析從肝臟流出的液體以及肝組織的病理學檢查，確定受試物在肝臟中所出現(xiàn)的變化和對肝臟的作用。3/25/202382離體肝臟灌流三大系統(tǒng)：恒溫循環(huán)系統(tǒng)灌流液循環(huán)系統(tǒng)氣體交換系統(tǒng)。應保證灌流液中充入O2和CO2

的比例約為95：5（V/V）。3/25/202383

離體肝臟灌流系統(tǒng)，恒定流量/壓力，循環(huán)系統(tǒng)離體肝臟灌流系統(tǒng)，恒定流量/壓力，非循環(huán)系統(tǒng)3/25/202384離體肝臟灌流技術在研究外源化合物肝臟中代謝的優(yōu)點：(1)灌流的肝臟本身仍屬活體實驗的范疇，保持了器官與細胞結構和功能的完整性，有完整的脈管系統(tǒng)，有正常的攝取、轉運、代謝、排泄和分泌功能，可在一定時間內動態(tài)觀察受試物進入肝臟后所發(fā)生的變化，故在很大程度上克服了某些體外實驗(如肝勻漿、游離肝細胞培養(yǎng)等)的不足。3/25/202385(2)離體肝臟灌流技術既能嚴格控制灌流液中底物和激素的濃度，又能排除肝外組織對其代謝和分布的影響，從而專一地研究肝臟對受試物的反應，從質與量上準確地給予評價。(3)灌流液的組成可精心調整，如pH值，電解質，攜氧能力，蛋白質結合特性及營養(yǎng)物質和受試物的濃度等，3/25/202386(4)灌流液的流速可任意調節(jié)。(5)可多次連續(xù)經灌流液和膽汁采樣，使攝取和排泄過程的動力學分析更精確，同時也可估算不同時間點肝內受試物的濃度。(6)離體灌流肝臟的功能狀態(tài)可連續(xù)監(jiān)測，每一處理前后可作自身對照。3/25/202387(7)易建立劑量-反應關系，即可在灌流液中加入不同劑量的受試物，任意造成一定的局部濃度而不受整體的干擾，可避免引起整體動物的中毒。(8)受試物的最終命運可以通過再循環(huán)系統(tǒng)測定，通過非循環(huán)系統(tǒng)可進行首過代謝或效應研究。3/25/202388(9)可以加入特別代謝物的抑制劑，以研究代謝途徑。(10)肝臟供體動物可預先處理，以了解受損組織與正常組織的代謝差異。但灌流技術并不能完全替代整體動物實驗和某些體外實驗，應相互結合、相互補充和相互驗證，才能獲得較為科學的結論。3/25/202389第四節(jié)細胞實驗細胞的體外培養(yǎng)，是指細胞在體外適宜的條件下生長和增殖的培養(yǎng)技術。通過一系列處理，從組織塊中分離出單個細胞，然后在體外培養(yǎng)，或傳代，可以觀察到細胞功能與形態(tài)的改變。3/25/202390由于細胞培養(yǎng)技術比器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)更簡便及人工合成培養(yǎng)基的應用，使這種培養(yǎng)技術規(guī)范化和標準化，實驗結果穩(wěn)定，可重復性強，可獲得大量生物學性狀均一的細胞進行研究，所得實驗結果相對可靠、準確。3/25/202391細胞培養(yǎng)在毒理學中主要應用：(1)模擬外環(huán)境人為地控制條件，觀察外環(huán)境各種物理、化學、生物等因素對細胞結構和功能產生的毒性作用?？捎^察單因素與多因素影響下的變化。(2)通過對靶細胞的直接細胞毒作用而避免了在整體動物的個體差異及體內各種復雜因素的干擾，體現(xiàn)其樣本的均一性和特異毒性作用。3/25/202392(3)以細胞為對象，通過各種手段和技術直接觀察或檢測到毒物引起的致突變、致畸、蛋白質合成、細胞間信息傳遞、染色體畸變、DNA損傷、細胞惡性轉化等。從細胞水平或分子水平闡述有害物作用機制。(4)毒理學研究內容廣泛，可以用人、動物的各種組織細胞觀察毒物的作用強度及細胞代謝規(guī)律，用于藥物的篩選及安全性評價。(5)不需要復雜的大型儀器設備，研究費用相對較低。3/25/202393注意點：細胞脫離體內生長條件在體外生長過程中，其細胞形態(tài)和功能會發(fā)生一定程度的改變，所獲得的結果可能與人體或動物整體實驗結果存在某些差異。不可將體外細胞毒理實驗結果直接推論到體內實驗結果。不能將培養(yǎng)細胞與體內的細胞完全等同看待。培養(yǎng)細胞存在一定的不穩(wěn)定性。3/25/202394細胞培養(yǎng)的類型（1）原代細胞培養(yǎng)（2）傳代細胞培養(yǎng)。3/25/2023951．原代細胞培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)，是從供體取得組織細胞后，在體外進行的首次培養(yǎng)。此期細胞活躍，可見細胞分裂，但不旺盛。一般維持l～4周。3/25/202396原代細胞特點生物學特性、形態(tài)結構和功能與體內原組織相似。細胞相互依賴性強，獨立生存能力差。具有二倍體遺傳性，最接近和反映體內特征3/25/202397原代細胞培養(yǎng)方法組織塊法消化法。3/25/202398(1)組織塊培養(yǎng)法：常用、簡便易行、成功率高。將組織塊剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)器皿表面。其器皿表面可根據不同細胞生長的需要做適當處理，如預先涂上一層膠原(鼠尾膠等)以利于上皮細胞生長3/25/202399(2)消化培養(yǎng)法是將組織通過消化酶(如胰酶、蛋白酶、EDTA、膠原酶等)作用進行消化分離，把妨礙細胞生長的細胞間質包括基質、纖維等除掉，使細胞分散成單個細胞懸液，接種到培養(yǎng)皿中貼附生長。3/25/2023100優(yōu)點：使細胞易于從外界吸收養(yǎng)分和排出代謝產物，可以很快得到大量活細胞，細胞在短時間內生長成片。適用于培養(yǎng)大量組織原代細胞。缺點：步驟繁瑣，易污染，一些消化酶價格昂貴，成本高。3/25/20231012．傳代細胞培養(yǎng)原代細胞經培養(yǎng)不斷增殖，原代培養(yǎng)細胞相互匯合后，需要進行分離培養(yǎng)，否則會影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程，稱之為傳代。3/25/2023102首次傳代注意點：①細胞生長匯合沒到一定程度(覆蓋瓶底壁約80%)不要急于傳代；②原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長，特別是上皮細胞和成纖維細胞并存的情況較為多見。此時可根據不同細胞對消化酶具有不同的耐受時間來進行分離和純化；3/25/2023103首次傳代注意點：③經消化的細胞在分散吹打時動作要輕巧，盡可能減少對細胞的損傷；④首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些，使細胞能盡快適應新環(huán)境而利于細胞的生存和增殖。3/25/2023104細胞系(cellline)。經傳代培養(yǎng)的細胞呈二倍體模型的細胞系稱二倍體細胞系(diploidcellline)為了維持二倍體細胞性質和原代細胞的生物學特征，應在傳代后早期凍存(常用細胞均在10代以內凍存)，做好細胞系的維持。3/25/2023105細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞人BHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠目前實驗室中常用的幾種細胞系

3/25/2023106

正常細胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，如人胚成纖維細胞可傳30-50代，相當于150-300個細胞增殖周期。癌細胞和發(fā)生轉化的細胞則能無限培養(yǎng)下去，目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養(yǎng)而成，此細胞系一直延用至今。3/25/2023107細胞株：由單個細胞增殖形成的細胞群體或從細胞系中獲得具有特殊性質或標志的培養(yǎng)物。細胞株的特殊性或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。3/25/2023108不能繼續(xù)傳代或傳代代數(shù)有限，稱為有限細胞株；可連續(xù)傳代(半年以上)則稱為連續(xù)細胞株。細胞系（株）的維持：通過換液、傳代、再換液、再傳代和細胞凍存來維持細胞系的特征并保持細胞系的穩(wěn)定的過程。3/25/2023109細胞培養(yǎng)過程：（1）細胞系（株）的適應（2）細胞系（株）的維持（3）培養(yǎng)細胞的純化3/25/2023110培養(yǎng)細胞的純化體外培養(yǎng)細胞在原代培養(yǎng)時，由于機體內的細胞都是混雜生長，因此絕大多數(shù)都是各種細胞混合生長，而在利用體外培養(yǎng)細胞進行實驗研究，都要求采用單一種類的細胞，這樣才能對某一種細胞功能、形態(tài)等在外界各種因素作用條件下的變化進行研究。因而培養(yǎng)細胞純化就成為體外培養(yǎng)細胞實驗研究的重要環(huán)節(jié)。3/25/2023111細胞純化可分為：①自然純化：自然純化是根據某一種細胞的增殖優(yōu)勢，以自然的增殖活力排擠其他細胞生長，留下生長優(yōu)勢的細胞，從而除去其他細胞達到細胞純化的目的。②人工純化：利用人工手段除掉某種細胞而達到純化細胞的目的。3/25/2023112a.酶消化法：利用上皮細胞比成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性強的特點，經過多次差別消化可將上皮細胞和成纖維細胞分開。b.反復貼壁法：如成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，利用貼附性能不同可將細胞分離純化。c.克隆法：即進行單個細胞的培養(yǎng)，生長后對每一克隆進行測試，選擇出目的克隆細胞。常用細胞純化方法3/25/2023113d.限定培養(yǎng)基方法：某些細胞生長過程中需要特定的培養(yǎng)物質，如培養(yǎng)雜交瘤細胞常用HAT培養(yǎng)基來篩選雜交瘤細胞而抑制其他細胞生長。e.流式細胞儀純化：根據細胞核酸含量，某些物質含量或細胞結構大小等參數(shù)，可采用流式細胞儀將細胞分離成不同的群體。3/25/2023114三、細胞的保存1.細胞的凍存2.細胞的復蘇3.細胞的運輸4.培養(yǎng)細胞的污染處理3/25/20231151.細胞的凍存：需加入保護劑如甘油、二甲亞砜以防冰晶形成，應緩慢降溫而達到凍存的目的。2.細胞的復蘇：要快速融化以避免水分進入細胞再結晶。慢凍快融3/25/20231163.細胞的運輸：①冷凍保存運輸：在放有液氮或干冰的特殊容器內放入培養(yǎng)細胞進行運輸。②充液運輸，即將培養(yǎng)細胞放在充滿培養(yǎng)液的瓶內，瓶內保留微量空氣，擰緊瓶蓋并用膠帶密封，妥善包裝運輸。3/25/20231174.培養(yǎng)細胞的污染與處理細胞能在體外環(huán)境生長良好，除需要好的條件和技術之外，最關鍵的是能否避免污染。(1)微生物污染途徑①空氣

定期消毒，必要時用4%甲醛和高錳酸鉀對培養(yǎng)室進行消毒。②器材污染3/25/2023118③操作污染

④血清污染在生產血清時就已被支原體或病毒污染。⑤組織樣本污染

特別是原代培養(yǎng)，其組織來源已被污染或在取組織過程中使用碘酒消毒，可造成碘污染使這些混入組織中的碘可以影響細胞生長。3/25/2023119（2）微生物污染對細胞的影響①真菌污染污染后易發(fā)現(xiàn)。多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物，一般肉眼可見，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)縱橫交錯、在細胞間形成絲狀、管狀或樹枝狀菌絲。念珠菌和酵母菌呈卵圓形，散在細胞間和周邊生長。3/25/2023120②細菌污染

常見的是革蘭氏陰性菌，尤其以大腸菌污染常見。細菌污染后因可產生大量酸性物質能改變培養(yǎng)液的pH值，并使培養(yǎng)液變混濁。細菌繁殖迅速并產生毒素，可抑制細胞生長，毒性大的能很快導致細胞崩解。3/25/2023121③支原體污染支原體是細胞培養(yǎng)中最常見、不易被發(fā)現(xiàn)而又干擾實驗結果的一種污染。支原體污染后可能改變細胞生長的特征酶種類、細胞膜的形成，也可導致染色體的畸變及細胞癌變等。但大多數(shù)細胞受污染后，無明顯變化或有多方面的微細變化；各類細胞對支原體的感受性和反應有差別。3/25/2023122(3)微生物污染的排除細胞受到霉菌、細菌或支原體污染，一般都很難排除和殺滅，對支原體尤為困難。預防微生物污染的方法：①抗生素②加溫處理③動物體內接種法

3/25/2023123①抗生素的使用原則：預防性使用比污染后使用更好，聯(lián)合使用比單一使用更好。反復使用抗生素可使微生物產生抗藥性，且對細胞本身也有一定影響。3/25/2023124②加溫處理根據支原體對熱敏感的特點，將污染的細胞放置在41℃中加熱5~10h，最長不超過18h以殺滅支原體。③動物體內接種法

將受污染細胞接種到動物皮下或腹腔，利用動物體內的免疫系統(tǒng)消滅支原體。3/25/2023125四、培養(yǎng)細胞的生物特征與檢測（一）培養(yǎng)細胞的常規(guī)觀察體外細胞培養(yǎng)在初代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)過程中，均要進行連續(xù)的動態(tài)性常規(guī)檢查，包括觀察細胞有無污染、生長狀態(tài)、形態(tài)和數(shù)量變化以及培養(yǎng)液是否需要更新和調整等。3/25/20231261.細胞的一般形態(tài)：每天或最多l(xiāng)~2d對細胞形態(tài)用倒置（相差）顯微鏡進行觀察，生長良好的細胞透明度大、折光性強、輪廓不清。2.細胞骨架：用細胞骨架特異性免疫抗體進行免疫組化染色，觀察微絲、微管和中間纖維的變化。3/25/20231273.細胞生長的觀察(1)生長曲線(2)細胞分裂指數(shù)(3)細胞周期3/25/20231284.細胞活力的測定(1)染料排除法：當細胞損傷或死亡時，某些染料可穿透變性的細胞膜與解體的DNA結合使其著色，而活細胞則能阻止這類染料進入細胞內，據此可鑒別死細胞與活細胞。3/25/2023129臺盼藍排斥試驗：將培養(yǎng)細胞制成細胞懸液，調整細胞濃度為106個/mL，取該細胞懸液0.lmL加入1滴0.4%臺盼藍，混勻，3min內用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞數(shù)和死細胞數(shù)，在光鏡下死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染。3/25/2023130(2)四唑鹽(MTT)比色法：顯色劑四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，其化學名：3-4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名噻唑藍，簡稱MTT?；罴毎€粒體中琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物并沉積在細胞中，而死細胞則無此功能。3/25/2023131(2)四唑鹽(MTT)比色法：二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的紫色結晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值可間接反映活細胞數(shù)量，在一定細胞數(shù)范圍內MTT結晶物形成的數(shù)量與細胞數(shù)成正比。該法特點是靈敏度高、重復性好、操作簡便。3/25/2023132(3)克隆形成率：是檢測培養(yǎng)細胞能否增殖的過硬指標之一，細胞制成懸液后，以低密度(2~5個細胞/cm2)接種，這樣單個細胞能持續(xù)增殖6代以上，形成細胞小群(克隆)的細胞百分數(shù)稱為克隆形成率，表示細胞群的活力。其細胞接種的存活率與細胞活力成正比。3/25/2023133（二）細胞染色體分析在有絲分裂中期，染色體長短、大小、著絲點等特征較為典型，容易觀察。染色體分析技術：染色體分帶姐妹染色單體分化染色染色體原位雜交染色體熒光基因標記法等3/25/20231341.染色體顯示核型分析：即分析各種細胞的染色體數(shù)目，大小及形態(tài)特征。一種蟬（Platypleura

kaempferi）的有絲分裂核型

3/25/20231352.染色體結構分析（1）染色體畸變檢測（2）微核檢測（3）染色體顯帶技術（4）姐妹染色單體差別染色（SCE)（5）高分辨染色技術（6）染色體原位雜交技術(FISH)3/25/2023136染色體原位雜交技術(FISH技術)用熒光標記的已知核酸探針，在組織、細胞及染色體上檢測特異的DNA或RNA序列。用于標記探針的半抗原報告分子多采用生物素或地高辛，然后分別與它們有特異性高親和力的抗生物素和抗地高辛抗體結合，再在配體上分別連接不同的熒光物質，如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅、羅丹明等。最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號。3/25/2023137熒光原位雜交顯示的端粒（上）和端粒序列（下）熒光原位雜交顯示的著絲粒衛(wèi)星DNA3/25/2023138FISH技術中的注意事項：①各種溶液及器材須無菌處理，操作時不得徒手觸摸載玻片、蓋玻片。②嚴格控制實驗條件。雜交時的反應溫度和雜交后沖洗時的條件應遵循所用探針的自身特點。3/25/2023139③細胞固定得當在固定時要首先考慮探針能否進入以及與目的核酸雜交是否方便。若固定不當，核膜上開孔太小，則探針難以進入核內。反之，核內DNA流失，有可能丟失片段。④選擇理想的探針最常見的問題是標記探針DNA分子過大，不易通過核膜進入核內。所以FISH中使用的探針一般要小。如果使用雙鏈探針結果不理想，則可考慮換用單鏈探針。3/25/2023140五、細胞凋亡凋亡是一種主動的細胞自我死亡淘汰過程，其形態(tài)特征、生化機制和啟動方式均與壞死不同。它是一個主動的、高度有序的、基因控制的、由一系列酶參與的過程。對整個機體來說，凋亡過程實際上是機體內受損細胞、不需要的細胞快速、無害、不改變組織功能的情況下被清除的過程。3/25/20231413/25/2023142細胞凋亡和細胞壞死的區(qū)別區(qū)別點細胞凋亡細胞壞死起因生理或病理性病理性變化或劇烈損傷范圍單個散在細胞大片組織或成群細胞細胞膜保持完整，一直到形成凋亡小體破損染色質凝聚在核膜下呈半月狀呈絮狀細胞器無明顯變化腫脹、內質網崩解細胞體積固縮變小腫脹變大凋亡小體有，被鄰近細胞或巨噬細胞吞噬無，細胞自溶，殘余碎片被巨噬細胞吞噬基因組DNA有控降解，電泳圖譜呈梯狀隨機降解，電泳圖譜呈涂抹狀蛋白質合成有無調節(jié)過程受基因調控被動進行炎癥反應無，不釋放細胞內容物有，釋放內容物。3/25/2023143(一)細胞凋亡的形態(tài)學評價1.倒置顯微鏡觀察法2.光學顯微鏡觀察法：①姬姆薩染色法②蘇木精染色法③石蠟切片蘇木素-伊紅(HE)染色法3.熒光顯微鏡觀察法4.投射電子顯微鏡觀察法3/25/2023144萊卡倒置顯微鏡

3/25/2023145尼康E-600光學顯微鏡3/25/2023146尼康E800熒光DIC顯微鏡3/25/2023147熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色），3/25/2023148JEM-1011透射電子顯微鏡內質網透射電鏡圖（偽彩色）3/25/2023149不同光源的波長名

稱可見光紫外光X射線α射線電子束0.1Kv10Kv波長（nm）390~76013~3900.05~130.005~10.1230.01223/25/2023150(二)細胞凋亡時DNA的改變1．DNALadder測定細胞發(fā)生凋亡或壞死，其細胞DNA均發(fā)生斷裂，細胞內小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質內出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征與壞死細胞區(qū)別。

3/25/2023151瓊脂糖凝膠電泳：凋亡細胞DNA電泳出現(xiàn)典型的梯狀（Ladder)條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶。簡易末端標記法LM-PCR

Ladder(連接介導的PCR檢測)3/25/20231522．大分子染色體DNA片段的測定細胞凋亡的早期，染色體斷裂成為50~300kb的DNA大片段。此時可采用脈沖電泳技術進行分離。3．凋亡細胞DNA含量的流式細胞儀分析

利用凋亡細胞DNA含量降低的特點進行定量檢測3/25/2023153細胞凋亡的機理細胞凋亡的途徑主要有兩條，①是通過胞外信號激活細胞內的凋亡酶caspase；②是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細胞內的重要蛋白降解，引起細胞凋亡。3/25/2023154Caspase家族Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，這些蛋白酶是引起細胞凋亡的關鍵酶，一旦被信號途徑激活，能將細胞內的蛋白質降解，使細胞不可逆的走向死亡。它們均有以下特點：①酶活性依賴于半胱氨酸殘基的親核性；②總是在天冬氨酸之后切斷底物，所以命名為caspase（cysteine

aspartate-specificprotease③都是由兩大、兩小亞基組成的異四聚體，大、小亞基由同一基因編碼，前體被切割后產生兩個活性亞基。3/25/2023155ICE家族成員A：3類caspase：藍色參與炎癥反應，紅色為執(zhí)行者，綠色為啟動者；B：caspase-3的結構模型；C：caspase-3的活化過程引自KatjaC.Zimmermann等20013/25/2023156（三）Caspase-3活性的變化Caspase-3與凋亡的關系非常密切。在細胞凋亡的晚期和死亡細胞中，Caspase-3的活性明顯下降?？赏ㄟ^檢測Caspase-3的活性強度來了解細胞凋亡的情況。3/25/2023157六、亞細胞組分分離細胞各種細胞器如線粒體、細胞核、內質網、溶酶體等的比重和大小都不相同，利用不同的理化性質對其進行分離。方法有差速離心、密度梯度離心、自由流電泳(FFE)、高分辨率密度梯度電泳(DGE)、免疫學分離、免疫自由流電泳(IFFE)等。過程包括組織細胞勻漿、分級分離和分析三步。3/25/2023158第四節(jié)分子生物學實驗3/25/2023159一、核酸印跡雜交(一)核酸雜交的基本原理核酸的變性：在化學和物理因素的影響下，DNA雙螺旋解旋成為單鏈的過程稱為核酸的變性(denaturation)。核酸的復性：變性的DNA兩條互補單鏈，在適當條件下重新結合成雙鏈的過程稱為DNA復性(re-naturation)或退火。3/25/2023160增色效應：由于核酸分子都存在共軛雙鍵，因而在260nm都有一個特定紫外吸收峰，吸收值因為變性程度而急劇升高，該現(xiàn)象稱為高色效應或增色效應。DNA的Tm值：在熱變性過程中，通常將增色效應達一半時即雙螺旋被解開一半時的溫度稱為變性溫度或解鏈溫度(melting-temperature,Tm)。

3/25/2023161變性和復性過程并不是簡單的正逆過程。復性開始時，兩條DNA單鏈隨機碰撞形成局部雙鏈，若在此時局部雙鏈周圍的堿基不能配對則會重新解離，繼續(xù)隨機碰撞，一旦找到了正確的互補區(qū)形成一定長度的堿基對即稱成核。一個穩(wěn)定的成核區(qū)有10~20個堿基對。在此基礎上兩條單鏈的其余部分堿基就像“拉鏈”那樣完成整個復性過程。3/25/2023162DNA變性和復性的過程即是核酸雜交的基本原理。核酸分子單鏈之間在一定條件下通過堿基互補序列，以非共價鍵形成穩(wěn)定的雙螺旋區(qū)，是核酸分子雜交的基礎。3/25/2023163雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基序列完全互補，只要有一定同源序性(不同來源)的單鏈彼此間有一定程度的互補序列就可以形成雜交鏈。雜交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合成的寡核苷酸單鏈與RNA或DNA單鏈之間進行。3/25/2023164影響Tm值的因素：(1)DNA堿基的組成：G-C含量越多，Tm值就越高，A-T含量越多，Tm值就越低。在標準條件下，Tm值與堿基對組成之間的經驗公式是：

Tm=69.3十0.41(G十C)%3/25/2023165(2)溶液的離子強度：同一種DNA分子在不同離子強度溶液中其Tm值不同。在低離子強度溶液中，Tm值較低，解鏈的溫度范圍較寬；在高離子強度溶液中，Tm值較高，解鏈溫度范圍較窄。(3)pH值：核酸溶液的pH值在5~9范圍內，Tm值變化不明顯。(4)變性劑：各種變性劑主要是干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，從而降低Tm值。3/25/2023166影響DNA復性速度的因素（１）DNA的大小

DNA片段小的比大的容易復性，反之亦然，信息含量少的比多的容易復性。（２）DNA濃度DNA濃度越大兩條互補鏈彼此相遇的可能性越大，復性的速度也就越快。DNA復性的速度與兩條反應單鏈濃度成正比。3/25/2023167探針(probe)：是指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法檢測的分子即稱為探針。核酸探針可以用于待測核酸樣品中特定基因序列的測定。為實現(xiàn)對探針分子的有效檢測，將探針分子用一定的標記物(示蹤物)進行標記。這種標記物可分為兩大類，即同位素標記和非同位素標記。3/25/2023168一個理想的探針標記物特性：①具有高度靈敏性；②標記物與探針結合后，絕對不影響雜交時堿基配對，也不影響探針分子的主要理化特性，尤其是對雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值無太大影響；③檢測方法高靈敏性、高特異性、假陽性率低外，對環(huán)境污染少，價格低廉；④若用酶促方法標記，應對酶的Km值影響不大，以保證不影響下一步酶促反應。3/25/2023169設計寡核苷酸探針的原則：①探針長度。一般要求在10~50bp之間，過長的探針合成困難，雜交時間也長，過短則特異性受影響。②G十C含量為40%~60%，超出此范圍會增加非特異性雜交。③探針分子內部無互補序列，否則探針內部會形成“發(fā)夾”結構。3/25/2023170④避免同一堿基重復出現(xiàn)，一般不能多于4個，如-GGGG-或-CCCC-。⑤選定某一寡核苷酸序列后，最好利用基因庫軟件進行分析，與已知的各種基因序列進行同源性比較，若與非靶基因序列有70%以上的同源性時，應重新設計探針。3/25/2023171(二)常用的核酸分子雜交固相分子雜交是將待測的靶核苷酸鏈預先固定在固體支持物上，而標記的探針則游離在溶液中，進行雜交反應后，使雜交分子留在支持物上，故稱固體雜交。固體雜交的優(yōu)點是通過漂洗能將未雜交的游離探針除去，留在膜上的雜交分子容易被檢測，能防止靶DNA的自我復性，故被廣泛應用。3/25/2023172固體支持物種類有硝酸纖維素膜、尼龍膜、化學激活膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等，以前兩種使用最為廣泛。常用的固相雜交類型有Southern印跡雜交、Northern印跡雜交和組織原位雜交等。

3/25/20231731．Southern印跡雜交是將電泳變性后的DNA轉移至固體支持物上，再與探針進行雜交。2．Northern印跡雜交是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉移到固體支持物(硝酸纖維膜)上，然后進行雜交的方法，此方法可用于測定細胞的總RNA或mRNA分子量大小。3/25/20231743．組織原位雜交是在細胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細胞內與RNA或DNA雜交，雜交反應在載物片上的細胞內進行。所用探針可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA探針。一般用50－300bp長度的探針較合適。該法可以用來確定細胞內被檢測對象在細胞內的位置。3/25/2023175二、蛋白質印跡雜交蛋白質印跡雜交(Westernblotting)

是將SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的非標記蛋白質轉移到固相載體上，再用特異性的抗血清或單克隆抗體對蛋白質進行鑒定及定量的技術。檢測蛋白質的靈敏度為1~5ng。3/25/2023176Westernblotting的基本原理：蛋白質經高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，各組分被固定于凝膠的網狀結構之中，為了進一步檢測它們的免疫活性，將電泳后的蛋白帶經電轉移技術，轉到固相的硝酸纖維素膜上，再和特異性的抗體結合，經直接或間接抗原-抗體反應法顯示特異性的陽性條帶。3/25/2023177三、聚合酶鏈式反應（PCR）

聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法