基因工程三組核算的提取

基因工程三組核算的提取第1頁(yè)/共55頁(yè)提綱前言DNA提取DNA提取的原則DNA提取的方法RNA提取RNA提取相關(guān)知識(shí)RNA提取方法及注意事項(xiàng)DNA和RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題分析核酸提取方法在不同材料中的改進(jìn)

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第2頁(yè)/共55頁(yè)前言核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子，原核生物的染色體DNA、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體DNA為單鏈環(huán)狀分子；大多數(shù)生物體內(nèi)RNA分子均為單鏈線性分子并具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如真核生物mRNA分子多數(shù)在3＇端帶有polyA結(jié)構(gòu)。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第3頁(yè)/共55頁(yè)DNA提取DNA提取的原則保證DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求

排除其它分子的污染

RNA、蛋白質(zhì)、多糖等Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第4頁(yè)/共55頁(yè)DNA純化要求核酸樣品中不存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降到最低程度；

排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA，反之亦然.Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第5頁(yè)/共55頁(yè)DNA提取的方法基因組DNA的提取CTAB法SDS法質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第6頁(yè)/共55頁(yè)基因組DNA提取主要方法CTAB法適用于植物組織，真菌等SDS法適用于動(dòng)物組織，血液，細(xì)胞，細(xì)菌，酵母等Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第7頁(yè)/共55頁(yè)CTAB法(植物DNA提取經(jīng)典法)原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第8頁(yè)/共55頁(yè)基因組DNA－CTAB法TrisHC（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除組份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第9頁(yè)/共55頁(yè)基因組DNA－CTAB法CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方組份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)5%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第10頁(yè)/共55頁(yè)

CTAB法流程圖植物材料液氮研磨細(xì)胞裂解裂解液抽提上層溶液酒精沉淀離心洗滌干燥溶解DNA溶液Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第11頁(yè)/共55頁(yè)SDS法原理

SDS陰離子去垢劑核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；對(duì)DNase、RNase有一定的抑制作用。高鹽(KAc或NH4Ac)或降低溫度（冰?。┦沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNAEvaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第12頁(yè)/共55頁(yè)SDS提取緩沖液的配方組份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)TrisHCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；

EDTA螯合Mg2+

或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；SDS裂解細(xì)胞，使蛋白變性，染色體離析；Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第13頁(yè)/共55頁(yè)SDS法流程圖動(dòng)物組織細(xì)胞組織勻漿細(xì)胞裂解裂解液抽提上層溶液酒精沉淀離心洗滌干燥溶解DNA溶液Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第14頁(yè)/共55頁(yè)基因組DNA－其它裂解方法根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠、超聲波、研磨、凍融化學(xué)方式：異硫氰酸胍、堿裂解生物方式：酶法Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第15頁(yè)/共55頁(yè)基因組DNA純化的方法吸附材料結(jié)合法：吸附材料純化原理硅質(zhì)材料高鹽低pH值結(jié)合核酸低鹽高pH值洗脫陰離子交換樹(shù)脂低鹽高pH值結(jié)合核酸高鹽低pH值洗脫磁珠磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第16頁(yè)/共55頁(yè)質(zhì)粒DNA提取堿裂解法煮沸法Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第17頁(yè)/共55頁(yè)堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第18頁(yè)/共55頁(yè)堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提上層溶液酒精沉淀離心洗滌干燥溶解DNA溶液溶液III中和Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第19頁(yè)/共55頁(yè)細(xì)胞器DNA提取線粒體葉綠體差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第20頁(yè)/共55頁(yè)DNA提取基本步驟

基因組DNA?新鮮材料，低溫保存?血液基因組DNA提取選擇有核細(xì)胞?細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)?含病毒的液體材料提取前先富集

質(zhì)粒DNA?對(duì)數(shù)期的菌體?培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力?低拷貝或大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體用量?菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存核酸沉淀Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第21頁(yè)/共55頁(yè)基因組DNA?材料過(guò)多影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低?針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：–植物材料－－液氮研磨–動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨–組培細(xì)胞－－蛋白酶K–細(xì)菌－－溶菌酶破壁–酵母－－破壁酶或玻璃珠質(zhì)粒DNA?菌體量適當(dāng)，除凈培養(yǎng)基?變性的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)（5分鐘）?控制復(fù)性時(shí)間，避免基因組DNA的污染?G＋菌、酵母細(xì)胞酶或機(jī)械處理材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存DNA提取基本步驟核酸沉淀Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第22頁(yè)/共55頁(yè)DNA提取基本步驟?采用吸附材料吸附分離DNA，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系?采用有機(jī)溶劑（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分而輕柔的混勻?離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間?針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存核酸沉淀Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第23頁(yè)/共55頁(yè)DNA提取基本步驟?蛋白質(zhì)的去除：–酚/氯仿抽提–使用變性劑（SDS、異硫氰酸胍等）–蛋白酶處理材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存核酸沉淀Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第24頁(yè)/共55頁(yè)DNA提取基本步驟?多糖的去除：

–多糖水解酶

–在提取緩沖液中加1/2體積氯苯，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。

–用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存核酸沉淀Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第25頁(yè)/共55頁(yè)DNA提取基本步驟?多酚的去除：

–加入還原劑：β巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等

–加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG，可防止酚類與DNA的結(jié)合?鹽離子的去除：

–70％的乙醇洗滌材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第26頁(yè)/共55頁(yè)DNA提取基本步驟?預(yù)冷的乙醇或異丙醇更充分沉淀?加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀?晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸溶解保存若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解核酸沉淀Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第27頁(yè)/共55頁(yè)分離核酸注意事項(xiàng)溫度不要過(guò)高，高溫如長(zhǎng)時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來(lái)的剪切力外，高溫本身對(duì)核酸分子中的有些化學(xué)鍵也有破壞作用。

控制PH范圍（PH4到10）保持一定離子強(qiáng)度減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)所用器械和一些試劑需要高溫滅菌，提取緩沖液中需加入核酸酶抑制劑Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第28頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第29頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取及常見(jiàn)問(wèn)題分析RNA提取相關(guān)知識(shí)

RNA提取方法及注意事項(xiàng)

RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題分析Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第30頁(yè)/共55頁(yè)細(xì)胞中RNA的含量

107

個(gè)細(xì)胞

10μg30mg動(dòng)物組織

30-100mg植物組織rRNA

占80-85%mRNA占1-5%

Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第31頁(yè)/共55頁(yè)mRNA的應(yīng)用RT-PCR,

Northern雜交,cDNA文庫(kù)構(gòu)建mRNA末端快速擴(kuò)增(RACE),差異表達(dá)(DDRT-

PCR),引物延伸反應(yīng),體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)記,RNA

酶保護(hù)試驗(yàn),RNA微注射(RNA

Microinjection)Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第32頁(yè)/共55頁(yè)RNA的不穩(wěn)定性內(nèi)因:核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基,易被水解外因:內(nèi)源、外源RNA酶含量豐富,加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性,不易失活Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第33頁(yè)/共55頁(yè)提取RNA的注意事項(xiàng)經(jīng)常更換新手套。皮膚和實(shí)驗(yàn)室用品上可能有

RNase,會(huì)導(dǎo)致RNase污染塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小時(shí),再滅菌玻璃器皿可在180℃烘烤4小時(shí)塑料制品和槍頭避免交叉污染Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第34頁(yè)/共55頁(yè)常用的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯(DEPC

)

與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑異硫氰酸胍目前是最有效的RNA酶抑制劑,裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第35頁(yè)/共55頁(yè)常用的RNA酶抑制劑RNasin

從大鼠肝或人胎盤中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。可以和多種RNA酶結(jié)合,使其失活氧釩核糖核苷復(fù)合物由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物,它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類物質(zhì),幾乎能完全抑制RNA酶的活性SDS、尿素、硅藻土等Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第36頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取流程示意圖

研磨或勻漿動(dòng)植物材料細(xì)胞裂解加入裂解液

(TRNzol)氯仿離心水相有機(jī)相PH5.7RNA基因組DNA

純化Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第37頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取流程示意圖等體積異丙醇沉淀70%乙醇洗滌沉淀晾干溶解RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脫傳統(tǒng)方法:有機(jī)溶劑抽提,得率高柱純化法:純度高,無(wú)有機(jī)溶劑水相

RNAEvaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第38頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取基本步驟材料準(zhǔn)備TRNzol

裂解細(xì)胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱純化

RNA溶解保存植物組織選取雜質(zhì)少生長(zhǎng)較快的幼嫩部培養(yǎng)細(xì)胞除盡培養(yǎng)液消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位細(xì)菌和酵母需要破壁處理樣品切成小塊投入液氮或?qū)ｉT的

RNA樣品儲(chǔ)存液中保存液氮研磨時(shí)不要使液氮揮發(fā)凈Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第39頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取基本步驟異硫氰酸胍、酚

(TRNzol)

裂解細(xì)胞滅活RNase

TRNzol要與細(xì)胞組織充分接觸裂解盡量充分材料準(zhǔn)備TRNzol

裂解細(xì)胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱純化

RNA溶解保存Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第40頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取基本步驟材料準(zhǔn)備TRNzol

裂解細(xì)胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱純化

RNA溶解保存氯仿抽提時(shí)充分混勻

離心分離兩相,保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間,使蛋白質(zhì)、多糖和DNA分布到有機(jī)相和中間層,RNA留在水相中

注意避免吸入中間層

不慎吸入再次用有機(jī)溶劑抽提Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第41頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取基本步驟材料準(zhǔn)備TRNzol

裂解細(xì)胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱純化

RNA溶解保存異丙醇低溫沉淀RNA高鹽低pH值,核酸與硅膠膜結(jié)合70%乙醇洗滌,晾干用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水或?qū)ｉT的試劑來(lái)洗脫或溶解RNA-70℃分裝保存或加入RNase抑制劑(RNAsafe)Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第42頁(yè)/共55頁(yè)DNA和RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題

及注意事項(xiàng)Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第43頁(yè)/共55頁(yè)問(wèn)題一：DNA降解1.材料不新鮮、反復(fù)凍融或細(xì)胞衰老2.提取操作過(guò)于劇烈，DNA被打斷3.外源核酸酶污染1.低溫保存，避免反復(fù)凍融。2.液氮研磨或勻漿組織，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液3.增加裂解液中螯合劑的含量4.細(xì)胞裂解后操作應(yīng)盡量輕柔5.試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌6.DNA分裝保存于緩沖液，避免反復(fù)凍融Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第44頁(yè)/共55頁(yè)問(wèn)題二：DNA樣品不純1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)2.DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)3.DNA中殘留有金屬離子1.重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前）2.重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)3.增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第45頁(yè)/共55頁(yè)問(wèn)題三：DNA提取量少1.實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗滌時(shí)DNA丟失1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材料2.動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁3.高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）4.低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間5.加輔助物，促進(jìn)沉淀6.洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第46頁(yè)/共55頁(yè)

RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題一：樣品不純1.蛋白2.多糖多酚3.DNA4.離子1.保證徹底的裂解和一定轉(zhuǎn)數(shù)一定時(shí)間的離心2.增加有機(jī)溶劑抽提的次數(shù)，用吸附柱純化3.減少處理樣品的量4.加入不含RNase的DNase處理；再次純化Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第47頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題二：得率低1.樣品太多或太少2.RNA在柱子上未洗出3.洗出液中有酒精1.減少或增加樣品使用量2.加入RNaseFree,放置幾分鐘再離心3.漂洗后再次離心Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第48頁(yè)/共55頁(yè)RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題三：降解1.樣品不新鮮或保存不當(dāng)2.RNase污染3.RNA溶液儲(chǔ)存不當(dāng)1.取新鮮的樣品；取樣后立即放入液氮或儲(chǔ)存液保存2.研磨樣品及時(shí)補(bǔ)充液氮3.嚴(yán)格處理相應(yīng)的器具和試劑4.70℃凍存，分裝使用Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第49頁(yè)/共55頁(yè)核酸提取方法在不同

材料中的改進(jìn)Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.第50頁(yè)/共55頁(yè)核酸提取方法在不同材料中的改進(jìn)

對(duì)于不同的材料相對(duì)應(yīng)的改進(jìn)方法不同，我們簡(jiǎn)要為大家介紹幾種：可以采用不同氯化鈉濃度比差別法來(lái)抽提DNA蛋白,得到一個(gè)較為理想的氯化鈉濃度（不同植物所需濃度不同）