基因工程的原理和技術

基因工程的原理和技術第1頁/共43頁一、基因工程的操作步驟：

①目的基因的獲??；②形成重組DNA分子；③重組DNA導入受體細胞；④篩選含有目的基因的受體細胞；⑤目的基因表達。第2頁/共43頁1.第一步：目的基因的獲取

（1）方法：①從基因文庫中獲取目的基因②利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術擴增目的基因（目的基因的序列已知）③化學方法合成目的基因（目的基因的序列已知）第3頁/共43頁

①從基因文庫中獲取目的基因用限制酶切成許多片斷將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入受體菌的群體儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。第4頁/共43頁②利用PCR技術擴增目的基因聚合酶鏈式反應，在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術?？梢垣@得大量的目的基因。第5頁/共43頁聚合酶鏈式反應（PCR技術）變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA復性（退火）：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈第6頁/共43頁雙鏈DNA1.變性升溫至95℃單鏈DNA2.復性降溫至60℃引物與母鏈結合3.延伸升溫至72℃DNA聚合酶解旋PCR技術與原理TaqDNA聚合酶有耐高溫的特點第7頁/共43頁思考：PCR技術擴增目的基因，需要什么前提和條件？過程如何？原理是什么？聚合酶鏈式反應(PCR技術)擴增原理：目的：前提：條件：DNA復制獲得大量的目的基因有一段已知目的基因（兩端）的核苷酸序列,以便根據這一序列合成引物。模板DNA（目的基因）耐高溫DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)四種脫氧核苷酸兩種DNA引物第8頁/共43頁人工合成基因的方法反轉錄法根據已知的氨基酸序列合成DNA③化學方法合成目的基因第9頁/共43頁蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)③化學方法合成目的基因通過化學合成的目的基因是否含有粘性末端？第10頁/共43頁大片段DNA打成許多小片段小片段DNA目的基因載入運載體細菌重組DNA分子重組DNA分子例如：從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲蛋白的基因如果運氣不好，在打成小片段時，有可能把抗蟲基因打斷……基因組文庫第11頁/共43頁如何從基因文庫中獲取目的基因?大片段DNA打成許多小片段小片段DNA目的基因載入運載體細菌重組DNA分子重組DNA分子基因組文庫對基因組文庫的所有細菌進行逐一篩查找出有抗蟲蛋白的菌落該菌落所攜帶的基因片段就含有目的基因例如：從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲蛋白的基因容易嗎？第12頁/共43頁

2、形成重組DNA分子（構建基因表達載體)基因表達載體的組成啟動子目的基因終止子復制起點標記基因通常用同一種限制酶切割目的基因和載體(質粒)，形成相同的粘性末端，再用DNA連接酶將二者連接,形成重組DNA分子（基因表達載體）。第13頁/共43頁3、將重組DNA導入受體細胞轉化常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因導入受體細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。第14頁/共43頁1.將重組DNA導入植物細胞農桿菌轉化法基因槍法2.將重組DNA導入動物細胞顯微注射技術（最多、最有效）3.將重組DNA導入微生物細胞Ca2+處理，以增加細菌細胞壁的通透性。第15頁/共43頁（1）將重組DNA導入植物細胞農桿菌轉化法基因槍法第16頁/共43頁（2）將重組DNA導入動物細胞顯微注射技術提純基因表達載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植第17頁/共43頁重組質粒大腸桿菌的擬核目的基因氨芐青霉素抗性基因（標記基因）將細菌用CaCl2處理，使細胞處于感受態(tài)，可促進細胞吸收DNA分子（3）如果是導入微生物（如細菌）第18頁/共43頁

感受態(tài)：細胞處于容易吸收外源性DNA的狀態(tài)。處于感受態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞.CaCl20℃重組載體感受態(tài)細胞42℃第19頁/共43頁抗氨芐青霉素基因α點為目的基因與質粒A的結合點四環(huán)素抗性基因目前把重組質粒導入細菌細胞時，效率還不高，導入完成后得到的細菌，實際上有的根本沒有導入質粒，有的導入的是普通質粒A，只有少數導入的是重組質粒。第20頁/共43頁

4.篩選含有目的基因的受體細胞目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記：－－－如以質粒做為載體可進行抗性的檢測原理：質粒上有抗生素的抗性基因方法：利用選擇培養(yǎng)基篩選第21頁/共43頁思考：通常為什么要選用含有兩個標記基因的運載體？第22頁/共43頁沒有質粒含目的基因的質粒正常質粒第23頁/共43頁沒有質粒含目的基因的質粒正常質粒第24頁/共43頁①檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因（關鍵）②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（表達）（2）常用的技術：①DNA分子雜交技術②蛋白質分子（抗原－抗體）間的雜交5.目的基因的表達（1）內容：第25頁/共43頁（2）基因工程的的原理及技術分子水平：DNA分子雜交技術核心－－DNA探針目的基因的脫氧核苷酸（單鏈）序列片段用熒光分子或放射性同位素標記看能否形成雜合的雙鏈區(qū)第26頁/共43頁檢測—鑒定——①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定等過程:A.首先取出轉基因生物的基因組DNAB.用含目的基因的DNA片段(單鏈)用放射性同位素等作標記,以此做探針C.使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中方法:DNA分子雜交方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA.第27頁/共43頁目的基因與質粒的連接第28頁/共43頁

基因DNA文庫的構建

將總DNA經過酶解，分離不同長短的DNA片段。包含的基因片段分別克隆在質粒或噬菌體載體上，感染細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構成了該生物的基因文庫。第29頁/共43頁基因探針：

基因探針就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列。它包括整個基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉錄而來的RNA。第30頁/共43頁DNA分子雜交示意圖采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第31頁/共43頁基因探針（DNA探針）與目的基因雜交，有無雜交帶第32頁/共43頁傳統(tǒng)的遺傳育種方法有哪些？傳統(tǒng)的遺傳育種方法能否解決不同種生物優(yōu)良性狀的重組問題？基因工程技術如何解決不同種生物優(yōu)良性狀的重組問題？基因工程的應用第33頁/共43頁基因工程的應用一、基因工程與作物育種二、基因工程與疾病治療（１）基因工程藥物（2）基因診斷（3）基因治療三、

基因工程與環(huán)境保護第34頁/共43頁基因工程的應用一、基因工程與作物育種1.抗蟲轉基因植物2.抗病轉基因植物3.其他抗逆轉基因植物（如抗鹽、抗旱、抗除草劑植物等）4.利用轉基因改良植物的品質基因工程在農業(yè)上的應用：1）高產、穩(wěn)產和具優(yōu)良品質的品種2）抗逆性品種基因工程在畜牧養(yǎng)殖業(yè)上的應用:第35頁/共43頁基因工程與疾病治療

基因工程藥品的生產在傳統(tǒng)的藥品生產中，某些藥品如胰島素、干擾素直接生物體的哪些結構中提?。克幤分苯訌纳锏慕M織、細胞或血液中提取。傳統(tǒng)生產方法的缺點由于受原料來源的限制，價格十分昂貴?？衫檬裁捶椒▉斫鉀Q上述問題？利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生產出各種高質量、低成本的藥品。第36頁/共43頁基因工程胰島素胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產量之低和價格之高可想而知。胰島素分子結構第37頁/共43頁基因工程胰島素將合成的胰島素基因導入大腸桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產生100g胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生產不但解決了這種比黃金還貴的藥品產量問題，還使其價格降低了30%-50%!胰島素生產車間第38頁/共43頁基因工程干擾素干擾素治療病毒感染簡直是“萬能靈藥”！過去從人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍貴”程度自不用多說。干擾素生產車間干擾素分子結構第39頁/共43頁SCID的基因工程治療重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人體免疫功能，只要稍被細菌或者病毒感染，就會發(fā)病死亡。這個病的機理是細胞的一個常染色體上編碼腺苷酸脫氨酶（簡稱ADA）的基因（ada）發(fā)生了突變?？梢酝ㄟ^基因工程的方法